模拟失重对白假丝酵母菌增殖和毒性的影响

【背景】近年来研究发现,失重条件可对一些致病微生物的增殖和毒性产生影响,白假丝酵母菌(Candida albicans)是典型的条件性致病真菌,在太空环境和人体中普遍存在,研究失重条件下白假丝酵母菌的增殖和毒性意义重大。【目的】利用旋转细胞培养系统(Rotary cell culture system,RCCS)模拟失重环境对白假丝酵母菌进行连续传代培养,检测模拟失重环境对白假丝酵母菌增殖情况、毒性以及基因表达的变化。【方法】将白假丝酵母菌接种在旋转生物反应器(High aspect rotating vessel,HARV)中,利用旋转细胞培养系统连续传代培养14 d,然后对菌株进行增殖速率测定、不同pH条件下增殖能力测定、生物膜相对形成能力测定和细胞毒性和动物毒力测定;利用转录组测序技术找出差异表达基因,结合性状分析模拟失重可能对白假丝酵母菌增殖和毒力的影响。【结果】与对照组相比,模拟失重组白假丝酵母菌对数期提前,增殖速率加快,在适宜pH条件下的增殖能力普遍提高,但其生物膜形成能力相对减弱,对LoVo细胞和小鼠的毒性减弱;转录组测序发现,模拟失重组共有280个基因表达差异达1.5倍以上(P0.05),其中248个上调、32个下调。差异基因经基因功能注释(Gene ontology,GO)和京都基因及基因组百科全书(Kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG)富集分析发现,相关胞膜形成及细胞分裂基因表达上调,生物膜形成、细胞黏附及共生粘连宿主基因表达下调。【结论】模拟失重环境可引起白假丝酵母菌增殖和毒性水平发生变化,相关改变可为研究失重环境对微生物的影响提供参考。     

逆转录套式PCR检测粪便样本中的SARS冠状病毒

为了观察SARS冠状病毒在SARS患者粪便中的存在规律,建立了检测SARS冠状病毒RNA的逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)方法,并应用该方法检测了241份SARS患者粪便样本。部分PCR产物应用测序技术进行验证。RT-PCR的灵敏度为10^-10稀释度的病毒原液(原液为10^8TCID50／ml)。241份粪便样本的总体检出率为24．1％(58／241),其中发病后的前10d和20d的检出率均为50．0％。随着发病时间的延长,阳性检出率呈下降趋势。应用RT-PCR从粪便中检测SARS冠状病毒是可行的,在发病50d以后仍有17．0％左右的阳性检出率,提示SARS恢复期患者具有排毒的可能性,给后续的卫生防疫措施提供了一定的参考数据。     

炭疽芽孢杆菌检测鉴定技术研究进展

炭疽芽孢杆菌的感染,无论是自然感染,还是作为生物恐怖和生物战的手段。快速检验和鉴定疽芽孢杆菌是最为关键的,只有正确识别生物战剂的种类,才能为正确实施防治措施指明方向。本文讨论了炭疽芽孢杆菌的检验鉴定技术,包括常规的分析培养,免疫学技术,核酸分析技术,生物传感器,基因芯片技术的应用和新诊断分子,如肽核酸与适配子的应用。     

链替代扩增反应研究进展

链替代扩增反应作为一种体外恒温酶控扩增体系,主要基于限制酶打开缺口和无外切酶活性的DNA聚合酶的聚合替代的原理,随着该反应体系各环节的不断改进,目前该方法已应用于细菌尤其是分枝杆菌DNA的检测、体外进化模型的建立、核酸定量及芯片杂交等多个方面。     

大肠杆菌hfq和rne-710基因的双质粒无痕敲除技术

基因敲除技术是了解基因功能的重要技术手段。以大肠杆菌K-12 MG1655基因组hfq(309 bp)和rne-710(1056 bp)基因为模型,首先构建Δhfq∷Spe和Δrne-710∷Spe菌株,通过融合PCR方法分别构建缺失hfq(309 bp)和rne-710(1056 bp)的融合片段并连接至辅助质粒,缺失hfq和rne-710的片段经重组分别替换壮观霉素抗性盒,得到无痕敲除株Δhfq和Δrne-710。双质粒无痕敲除和融合PCR方法相结合为大片段基因缺失开辟了新的途径。     

模拟失重环境对大肠杆菌K12表型异质性亚群菌株的影响

【背景】我国未来几年深空探索任务将呈"井喷式"发展,微生物对于航天活动的影响越来越引起关注,而国内外少有表型异质性亚群的研究。【目的】从表型异质性的角度探讨低剪切力模拟失重环境(Low-shearmodeledmicrogravity,LSMMG)和低剪切力正常重力环境(Low-shearnormalgravity,LSNG)对大肠杆菌K12造成的影响。【方法】利用旋转细胞培养系统模拟失重环境对大肠杆菌K12进行连续传代培养,从单克隆形态、颜色以及菌体形态等方面挑选出表型异质性的亚群菌株,对不同菌株进行增殖速率、抗生素耐药性、生物被膜形成、环境压力抵抗力以及细胞毒性的测定,以此评估低剪切力和模拟失重环境对大肠杆菌K12的影响。【结果】利用旋转细胞培养系统连续传代培养,总共分离出4株形态不同的表型异质性亚群菌株,其中2株来自模拟失重组(M1,Ma),另外2株来自正常重力对照组(N1,Na);4株亚群与原始菌株(P)相比,在增殖速率、生物被膜形成、环境压力抵抗力和细胞毒性方面均有增强或减弱的明显变化,对于抗生素的耐药性无明显变化。【结论】低剪切力模拟失重环境以及存在低剪切力的正常重力环境均能引起大肠杆菌表型异质性变化,与原始菌株相比,表型异质性亚群菌株在分化上并没有统一的方向,但仍需警惕那些可能对人类造成危害的变化表型。     

超分辨显微技术结合smFISH方法在E. coli sRNA SgrS定位中的应用

细菌调节小RNA通常与靶mRNA结合,影响翻译和mRNA降解过程.了解细菌小RNA的定量和定位信息,将有助于揭示细菌转录后水平的调控机制.小RNA SgrS通过抑制ptsG mRNA翻译起始,参与细菌磷酸葡萄糖代谢的应激过程.本研究应用单分子荧光原位杂交(smFISH)方法和超分辨显微技术可视化定位大肠杆菌细胞内小RNA SgrS,并初步验证伴侣分子Hfq蛋白和RNaseE降解酶对小RNA SgrS定位的影响.选取大肠杆菌模式菌MG1655 (野生株)、sgrS敲除株(△sgrS)和过表达株(△sgrS-pBAD-SgrS),使用RNA印迹和smFISH方法验证SgrS的过表达.应用smFISH方法分别在野生菌株、hfq敲除株(△hfq)和rne敲除株(△rne-710)中定位小RNA SgrS和ptsG mRNA,超分辨成像观察.与野生株相比,△hfq和△rne-710中SgrS主要定位于近膜区域,ptsG mRNA定位于细菌胞浆中,并且这两种RNA拷贝数均极显著增加.以上结果表明,分别敲除大肠杆菌hfq和rne-710基因导致SgrS和ptsG mRNA的表达量增加. smFISH方法和超分辨技术的结合应用为细菌RNA的直观定量和定位提供了高敏感性的检测方法,可用于基因调控的功能研究.     

地高辛标记的Northern blot检测鼠疫菌sRNA

[目的]随着高通量测序方法的应用,越来越多的sRNA (small non-coding RNA,sRNA)需验证.本研究建立用地高辛标记Northern blot检测鼠疫菌sRNA的技术,为细菌sRNA验证提供一种灵敏、特异的方法.[方法]在低铁条件下,提取鼠疫菌总RNA,10％ dPAGE分离后电转到尼龙膜上并用紫外线交联RNA.膜经地高辛标记RyhB1或RyhB2寡核苷酸RNA探针过夜杂交后洗脱、封闭和免疫检测,最后曝光显影.[结果]地高辛标记的Northern blot曝光时间为20 s-3 min,RyhB1或RyhB2检测灵敏度分别为0.005 μg和0.05 μg.RyhB1或RyhB2探针特异性好,相互间无交叉反应.带正电或中性的尼龙膜都适用于杂交反应.RNA探针在42℃-65℃内杂交均可,提高温度可减少非特异性反应;而DNA探针杂交温度需摸索.[结论]本研究成功构建一种地高辛标记Northern blot检测鼠疫菌sRNA技术,具有特异性好、灵敏度高、探针易保存、曝光时间短等优点,为细菌sRNA验证和功能研究提供有利工具.     

建立基于RNA免疫共沉淀技术的鼠疫耶尔森菌Hfq蛋白相关sRNA的体内验证方法

目的：建立RNA免疫共沉淀方法,为鼠疫耶尔森菌Hfq蛋白相关非编码小RNA（sRNA）提供体内验证方法。方法：首先在RNA结合蛋白Hfq下游加入Flag标签,用Flag标签抗体进行免疫共沉淀,获得蛋白-RNA复合物,然后从沉淀的蛋白-RNA复合物中分离得到纯化的RNA;通过Western印迹检测各步骤Hfq蛋白的表达,再利用Northern印迹检测目的sRNA--RyhB1和RyhB2。结果：构建了带有Flag标签的RNA结合蛋白Hfq的载体,此载体转导入hfq缺失株后与鼠疫菌野生株的生长曲线无明显差异;通过RNA-蛋白免疫共沉淀技术鉴定出已知与鼠疫菌Hfq蛋白结合的2个sRNA--RyhB1和RyhB2。结论：建立了利用RNA-蛋白免疫共沉淀鉴定与鼠疫菌Hfq蛋白结合的sRNA的技术,为细菌sRNA的验证、功能研究和体内蛋白质与RNA相互作用研究提供了有利工具。     

模拟空间环境下低剪切力对肺炎克雷伯氏菌Ⅲ型菌毛表达调控机制的初步研究

目的:探索模拟空间环境下低剪切力对肺炎克雷伯菌Ⅲ型菌毛表达的影响及其可能机制,为空间和地面感染防控研究的靶标筛选提供新的思路和依据。方法:以肺炎克雷伯菌ATCC BAA-1705株M1亚群为研究对象,以不同的剪切力进行一系列试验,通过甘露糖抑制的酵母凝集试验、透射电镜观察对表型进行研究,通过qRT-PCR及转录组测序结果分析对表型进行验证及其可能机制探究。结果:甘露糖抑制的酵母凝集试验、透射电镜观察等表型试验表明,随着剪切力的增高,Ⅲ型菌毛的表达降低;qRT-PCR及转录组结果测序分析发现,低剪切力条件下,Ⅲ型菌毛结构基因及相应调控基因表达上调,进一步验证了以上发现。针对17个c-di-GMP表达相关的GGDEF基因进行转录组测序分析,并与qRT-PCR试验结果相比对,发现了7个差异表达较显著的基因(KPHS-06770、KPHS-17760、KPHS-29590、KPHS-38170、KPHS-39010、KPHS-39950和KPHS-47910),随着剪切力的降低,这7个基因的表达明显升高。结论:低剪切力促进肺炎克雷伯菌Ⅲ型菌毛的表达,其机制有可能是以上7个基因中的一个或多个表达上调,造成局部c-di-GMP表达水平增高,从而促进Ⅲ型菌毛的表达。以上研究提示,在低剪切力的空间环境下,肺炎克雷伯菌Ⅲ型菌毛的表达增加,可能造成其生物被膜和致病能力改变,从而潜在威胁航天员的健康。