多酶恒温扩增核酸试纸条法快速检测肺炎支原体方法的建立及应用

【背景】肺炎支原体是导致儿童和青少年呼吸道感染的重要病原体,长期以来由于其临床表现不特异而容易错过最佳治疗时期。【目的】结合多酶恒温扩增(multienzyme isothermal rapid amplification,MIRA)技术和核酸试纸条建立一种快速检测肺炎支原体的方法。【方法】以肺炎支原体社区获得性肺炎呼吸窘迫综合征(community acquired respiratory distress syndrome, CARDS)毒素编码基因为靶基因设计引物和探针,对反应体系的温度、时间等进行优化,评估其敏感性,通过检测肺炎支原体和其余7种病原体分析其特异性,并对35份临床样本进行验证。【结果】MIRA核酸试纸条法在37℃条件下,15 min内便可完成对肺炎支原体的检测,最低检出限为10 copies/μL;除肺炎支原体外,其余7种病原体均不能扩增,特异性较好。以实时荧光PCR检测为标准,MIRA核酸试纸条法对35份临床样本检测后的诊断特异度为100.00%、灵敏度为96.15%、阴性预测值为90.00%、阳性预测值为100.00%。【结论】本研究建立了MIRA核酸试纸条法...     

解脲脲原体脂质相关膜蛋白通过激活核因子κB调控诱导性一氧化氮合酶在小鼠巨噬细胞中的表达

为探讨解脲脲原体(Uu)的脂质相关膜蛋白(LAMPs)诱导小鼠巨噬细胞表达诱导性一氧化氮合酶(iNOS)的分子机制,从解脲脲原体提取的脂质相关膜蛋白,刺激小鼠巨噬细胞,以RT_PCR、Western blot等方法分析iNOS的表达及NO的产生;用细胞免疫化学、间接免疫荧光及Western blot等方法检测核因子κB(NF_κB)的激活,另外检测了NF_κB的特异性抑制剂二硫代氨基甲酸吡咯烷(PDTC)和蛋白酶抑制剂放线菌酮(CHX)对iNOS的表达及NF_κB激活的影响。结果表明,解脲脲原体的LAMPs通过激活NF_κB诱导小鼠巨噬细胞表达iNOS的mRNA和蛋白,且能以时间和剂量依赖方式刺激小鼠巨噬细胞产生NO,NF_κB的抑制剂PDTC或蛋白酶抑制剂放线菌酮(CHX),可抑制NF_κB的激活及iNOS的表达。由于解脲脲原体的脂质相关膜蛋白通过激活NF_κB诱导小鼠巨噬细胞表达iNOS和产生NO,因而可能是一个重要的致病因素。     

地高辛标记的Northern blot检测鼠疫菌sRNA

[目的]随着高通量测序方法的应用,越来越多的sRNA (small non-coding RNA,sRNA)需验证.本研究建立用地高辛标记Northern blot检测鼠疫菌sRNA的技术,为细菌sRNA验证提供一种灵敏、特异的方法.[方法]在低铁条件下,提取鼠疫菌总RNA,10％ dPAGE分离后电转到尼龙膜上并用紫外线交联RNA.膜经地高辛标记RyhB1或RyhB2寡核苷酸RNA探针过夜杂交后洗脱、封闭和免疫检测,最后曝光显影.[结果]地高辛标记的Northern blot曝光时间为20 s-3 min,RyhB1或RyhB2检测灵敏度分别为0.005 μg和0.05 μg.RyhB1或RyhB2探针特异性好,相互间无交叉反应.带正电或中性的尼龙膜都适用于杂交反应.RNA探针在42℃-65℃内杂交均可,提高温度可减少非特异性反应;而DNA探针杂交温度需摸索.[结论]本研究成功构建一种地高辛标记Northern blot检测鼠疫菌sRNA技术,具有特异性好、灵敏度高、探针易保存、曝光时间短等优点,为细菌sRNA验证和功能研究提供有利工具.     

建立基于RNA免疫共沉淀技术的鼠疫耶尔森菌Hfq蛋白相关sRNA的体内验证方法

目的：建立RNA免疫共沉淀方法,为鼠疫耶尔森菌Hfq蛋白相关非编码小RNA（sRNA）提供体内验证方法。方法：首先在RNA结合蛋白Hfq下游加入Flag标签,用Flag标签抗体进行免疫共沉淀,获得蛋白-RNA复合物,然后从沉淀的蛋白-RNA复合物中分离得到纯化的RNA;通过Western印迹检测各步骤Hfq蛋白的表达,再利用Northern印迹检测目的sRNA--RyhB1和RyhB2。结果：构建了带有Flag标签的RNA结合蛋白Hfq的载体,此载体转导入hfq缺失株后与鼠疫菌野生株的生长曲线无明显差异;通过RNA-蛋白免疫共沉淀技术鉴定出已知与鼠疫菌Hfq蛋白结合的2个sRNA--RyhB1和RyhB2。结论：建立了利用RNA-蛋白免疫共沉淀鉴定与鼠疫菌Hfq蛋白结合的sRNA的技术,为细菌sRNA的验证、功能研究和体内蛋白质与RNA相互作用研究提供了有利工具。     

白色念珠菌胃癌株对细胞粘附作用的研究

研究白色念珠菌 (candidaalbicans)正常人口腔株与胃癌株对口腔粘膜细胞及肺上皮细胞的粘附性能。将白色念珠菌与正常人口腔颊粘膜细胞或培养的人肺上皮细胞于 37℃温育一定时间后 ,计算每个细胞粘附白色念珠菌数。白色念珠菌胃癌株对两类细胞粘附能力均较正常人口腔株强 ,其差异有显著性 (p <0 .0 1)。粘附性是致病菌侵袭力的重要机制 ,粘附性增强是白色念珠菌由正常微生物群成员转变为条件致病菌的重要条件。     

两步PCR介导的Red重组技术快速敲除鼠疫耶尔森菌sRNA及染色体大片段

【目的】利用Red同源重组系统,通过二步PCR法建立一种适合鼠疫耶尔森菌s RNA和大片段染色体基因敲除的方法。【方法】第一步PCR先扩增出目的基因的上、下游同源臂(600–1000 bp)及卡那抗性盒,再以上、下游同源臂及卡那抗性盒等摩尔混合物为模板,通过融合PCR获得含上下游同源臂及卡那抗性盒的线性突变盒,再将此突变盒的PCR产物电转到含有pKD46质粒的鼠疫201菌株,在阿拉伯糖的诱导下,p KD46质粒表达Red重组酶,促使卡那抗性盒替换目的基因,最后对获得的重组克隆进行PCR鉴定。【结果】本研究通过两步PCR法构建600–1000 bp的同源臂,提高了同源重组效率,并将鼠疫菌sRNA RyhB1(108 bp)和RyhB2(106 bp)和染色体大片段47-2(10.4 kb)、47-3(21.6 kb)、47-3a(9.2 kb)及47-3b(6.1 kb)成功敲除。【结论】基于Red重组系统构建的二步法突变技术,是一种简单、高效的精确修饰鼠疫菌s RNA及大片段染色体的方法,适合于鼠疫菌全基因组的基因敲除,为鼠疫菌基因表达与调控、致病和毒力等研究提供有力的工具。     

酶促重组等温扩增实时荧光法快速检测肺炎支原体方法的建立及应用北大核心CSCD

利用酶促重组等温扩增(enzymatic recombinase amplification,ERA)技术建立快速检测肺炎支原体的实时荧光检测方法。针对肺炎支原体P1基因设计特异性引物和探针,优化反应条件,分析其敏感性和特异性,并对临床样本进行验证。ERA实时荧光法在25-40℃均具有扩增能力,在35℃条件下对肺炎支原体的扩增效果最好,20 min内可完成扩增;该法对肺炎支原体的检出限为10^(3) copies/μL;并对其他6种呼吸道病原体进行检测,均无扩增曲线产生,有较好的特异性;以荧光定量PCR法检测结果为标准,ERA实时荧光法对34份临床样本的检测结果的诊断敏感度为96.15%、特异度为100%、阳性预测值为100%、阴性预测值为88.89%。本研究构建的ERA实时荧光法可以快速简单、灵敏和特异地检测出肺炎支原体,满足现场检测的需求。