龙眼胚性愈伤组织DlGRAS4与DlGRAS54基因的克隆及表达分析

以龙眼松散型胚性愈伤组织为实验材料,采用RT-PCR结合RACE法,克隆了植物特异转录调控因子DlGRAS4和DlGRAS54的cDNA全长序列和DNA序列,并进行生物信息学以及表达分析。结果表明:DlGRAS4全长1 668bp,开放阅读框(ORF)1 296bp,编码431个氨基酸(GenBank登录号:KC127683);DlGRAS54全长2 113bp,ORF 1 659bp,编码552个氨基酸(GenBank登录号:KC127684);DlGRAS54的DNA序列在5′-UTR含有1个1 533bp的内含子。生物信息学分析表明:DlGRAS4和GRAS54是不稳定亲水蛋白,不含信号肽,具有跨膜结构和GRAS家族的保守结构域,亚细胞定位于细胞膜中;与毛果杨、葡萄、蓖麻和可可等具有较高的同源性。系统进化树分析显示,DlGRAS54与拟南芥AtPAT1、葡萄VvPAT1、毛果杨PtPAT1、大豆GmPAT1处于同一分枝;DlGRAS4与拟南芥AtSCL23、玉米ZmSCL23处于同一分枝。推测DlGRAS4和DlGRAS54是GRAS基因家族的成员。qPCR结果表明,DlGRAS4在整个发育阶段转录水平呈"W"型变化趋势,在球形胚和子叶形胚阶段的表达量达最大值;DlGRAS54在整个发育阶段的转录水平呈"M"型变化趋势,在球形胚和鱼雷形胚阶段表达量达最大值,表明DlGRAS4和DlGRAS54主要在发育的中晚期起作用。外源赤霉素处理后DlGRAS4和DlGRAS54的表达量明显上调,说明DlGRAS4和DlGRAS54对赤霉素处理能做出积极的反应。     

苋菜甜菜红素合成相关基因AmMYB1的克隆及表达分析

应用RACE技术,从‘大红’苋菜中克隆到1条MYB基因cDNA全长序列,命名为AmMYB1(登录号为KU557504)。AmMYB1基因开放阅读框为723bp,可编码240个氨基酸。其基因组序列与cDNA比对后显示,AmMYB1基因含有1个内含子。生物信息学分析表明,AmMYB1具有2个连续的MYB结构域,是一个典型的R2R3-MYB;同源分析显示,该基因编码的氨基酸序列与甜菜红素相关BvMYB1的一致性最高,达到54%。亚细胞定位结果显示,AmMYB1蛋白定位于细胞核。实时荧光定量PCR分析表明,AmMYB1基因在‘大红’苋菜叶片红色部位的表达量高于绿色部位;在甜菜红素含量高的叶和茎中表达量明显高于根;在光照条件下表达量高于遮光处理;在红叶品种中的表达量高于绿叶品种。研究结果表明,AmMYB1基因可能是苋菜甜菜红素合成途径中重要的正调控因子。     

茶树原位转化方法的建立

解决茶树缺乏高效、稳定的遗传转化体系问题,建立了一种基于根癌农杆菌介导的茶树原位转化转基因方法,为茶树基因功能研究和种质创新奠定坚实的基础.以茶树品种'铁观音'、'白叶1号'和'龙井43'的实生幼苗为受体材料,进行去顶芽和腋芽处理.利用根癌农杆菌菌液侵染实生苗伤口,通过抗性筛选获得再生芽,经分子生物学鉴定后,采用短穗扦...     

香蕉ADA1家族成员鉴定及其在生物和非生物胁迫下的表达分析

Spt-Ada-Gcn5-乙酰转移酶(Spt-Ada-Gcn5-acetyltransferase, SAGA)是高度保守的辅助转录起始复合物,转录接头蛋白-激活的改变/缺失亚基1 (alteration/deficiency in activation 1, ADA1),也称作组蛋白H2A功能互作因子1 (histone H2A functional interactor 1, HFI1),它是SAGA核心模块中的一个亚基,在植物的生长发育和抗逆性方面发挥着重要的作用。为了解香蕉ADA1的分子特性,本研究基于香蕉基因组数据库,对香蕉ADA1基因家族成员进行鉴定,分析其基本理化性质、系统进化、选择压力、启动子顺式作用元件及生物与非生物胁迫下的表达等。结果显示,香蕉A、B及阿宽蕉基因组中分别有10、6、7个ADA1家族成员;成员均为不稳定的亲水性蛋白,均保守地含有SAGA-Tad1结构域,MaADA1和MbADA1均可与SAGA核心模块中的SAGA相关因子11 (SAGA-associated factor 11, Sgf11)互作;系统发育显示香蕉ADA1基因家族成员可划分为3个亚族,进化过程中大多受纯化选择;香蕉ADA1基因家族成员的基因结构差异性较大;香蕉ADA1基因家族成员含有多个响应激素的作用元件;MaADA1-1可能对香蕉在低温胁迫下的抗性起着重要的作用,MaADA1均响应香蕉枯萎病菌胁迫。本研究表明,ADA1基因家族成员在香蕉中高度保守,并可能响应生物与非生物胁迫。     

龙眼松散型胚性愈伤组织发生过程中相关蛋白的表达分析

以龙眼‘红核子’品种(Dimocarpus longan Lour.cv.Honghezi)松散型胚性愈伤组织(FEC)为材料,采用固相双向凝胶电泳技术和质谱鉴定技术,对其生长过程中相关蛋白的表达变化进行研究。结果表明:(1)龙眼FEC生长过程中,总蛋白点数在400~800之间,蛋白点数变化虽有升降起伏,但总体呈上升趋势;蛋白质pI集中在4~7之间;蛋白质分子量在14~97kD之间,表达量相对较高的是分子量在30~66kD的蛋白质,且30~45kD的蛋白点逐渐增多,45~66kD的逐渐减少。(2)龙眼FEC生长过程中质谱鉴定66个蛋白,其中28.79%为功能未知蛋白,30.30%涉及胁迫应答和抗氧化,10.61%涉及能量和糖代谢,10.61%涉及蛋白代谢和修复,6.06%涉及细胞骨架重构,4.55%蛋白是调控蛋白,3.03%是核酸代谢相关蛋白,而所占比例最少的为信号转导与细胞凋亡相关蛋白、氨基酸代谢相关蛋白、脂类代谢相关蛋白,以及维生素代谢相关蛋白均为1.52%。(3)龙眼FEC生长过程中,胁迫反应/氧化还原相关蛋白(抗坏血酸类过氧化物酶R147、R158和HC21,苄基醚还原酶同系物TH6、谷胱甘肽过氧化酶以及过氧化物酶L26)表达高峰出现在前期10~20d,而过氧化物酶4多在后期40~50d表达;蛋白质合成及修复的相关蛋白,只有蛋白质异形体1在10~30d表达量高,其他蛋白的表达高峰出现在前期10~20d之间,能量与糖代谢相关酶在整个过程中都有较大量的表达。     

闽江流域野生蕉(Musa itinerans)遗传多样性和遗传结构的ISSR分析

采用ISSR分子标记技术对福建省闽江流域10个野生蕉自然居群的遗传多样性和遗传结构进行分析,结果显示:12条ISSR引物共检测出117个条带,105个多态性条带,多态性百分率为89.7%;野生蕉Nei遗传多样性指数为0.244,Shannon's信息指数为0.381,其中三明野生蕉遗传多样性水平最高,且不同自然居群间遗传多样性指数之间具有显著性差异;总遗传变异系数为0.589,基因流为0.349,居群间的遗传分化程度高于居群内;基于遗传距离的聚类结果与模型聚类结果均聚为3大类,分别为沙溪支流的三明野生蕉类群、闽江上游及附近支流的南平野生蕉类群和闽江下游的福州野生蕉类群。研究认为,闽江流域野生蕉资源丰富的遗传多样性主要来源于自然居群间生境异质化所引起的高频率遗传变异,且三明野生蕉类群的遗传多样性和遗传分化程度最高,可能是福建野生蕉的起源中心,也是野生蕉资源开发和利用的最主要群落。此外,水流是闽江流域野生蕉遗传迁移最关键的自然主导因素。     

龙眼miR171家族进化特性及其表达分析

为了解龙眼miR171家族的进化特性及其功能,该研究以龙眼mRNA和miRNA数据库中获得的miR171家族7个前体序列(pre-miRNA)和9条成熟体序列为基础进行生物信息学预测和表达分析。mfold预测显示,premiR171家族成员均能形成典型二级结构,其最小折叠自由能(dG)介于-39.37~-55.13kal/mol,且家族成员中除pre-miR171-scaffold112和pre-miR171f-scaffold38外,其他成员包含的成熟序列与vvi-miR171a、ptc-miR171f以及ctr-miR171等成熟体完全匹配。NJ进化树分析发现,龙眼pre-miR171家族与柑橘、毛果杨具有较高相似性。psRNAtarget靶标预测显示,龙眼miR171家族的主要靶标为Scarecrow-like6,与其他植物的miR171靶标相同。实时荧光定量PCR分析表明,pre-miR171家族成员均在龙眼雄花中表达提高,而在果实中表达量降低。研究认为,龙眼miR171家族在进化过程中具有高度保守性,在龙眼生长发育过程中主要参与雄花形成。     

荔枝古树胚性愈伤组织LcCu/Zn-SOD3基因启动子的克隆及功能验证

以荔枝古树"宋荔"胚性愈伤组织为材料,采用接头染色体步移法,分离获得LcCu/Zn-SOD3启动子片段长度为1 426bp,命名为ProLcCSD3(GenBank登录号:KF672186.1)。生物信息学分析表明,该启动子含有多个逆境应答元件、激素应答元件、胚乳特异表达元件,且可能受WRKY和MYB等转录因子调控。通过双酶切方法,以ProLcCSD3替换载体pCAMBIA1301上的CaMv35S启动子,构建了重组质粒p1301-proLcCSD3-GUS,并成功转化农杆菌EHA105和GV3101。注射烟草的瞬时表达分析表明,该启动子片段可以驱动下游报告基因表达。转化拟南芥分析表明,该启动子驱动的下游GUS可以在拟南芥的根、茎、叶中表达,且可响应NaCl、PEG-6000、ABA、MeJA和损伤等非生物胁迫。研究表明,荔枝古树LcCu/Zn-SOD3可能参与多种非生物胁迫应答和激素信号转导途径。     

文心兰铁氧还蛋白基因克隆定位及表达分析

采用RACE-PCR法,从‘小樱桃’文心兰中克隆到一个全长989bp的铁氧还蛋白基因cDNA序列,命名为OnFd(登录号KX461907)。OnFd基因开放阅读框长为465bp,预测可编码154个氨基酸;gDNA和cDNA序列比对结果显示OnFd基因不含内含子。生物信息学分析表明,OnFd具有1个典型的[2Fe-2S]结构域;同源分析显示,OnFd与玉米Fd3的相似度最高(64.29%)。蛋白亚细胞定位结果显示OnFd定位于叶绿体。实时荧光定量PCR检测发现:OnFd基因在花中表达量最高,其次是叶与根,在假鳞茎中表达量最低;接种病原菌研究显示,文心兰感染软腐病后,各个部位的OnFd基因表达量均呈上升趋势,尤其是接种部位假鳞茎在接种病原菌1d后表达量便表现出极显著上调,并且在5个感病阶段的表达量是健康植株的2.83~3.98倍。研究表明,OnFd基因可能在文心兰响应抗软腐病过程中具有重要作用。