人甲状旁腺激素在大肠杆菌中的表达及鉴定

化学合成人甲状旁腺激素（hPTH）全长基因,克隆到大肠杆菌表达载体pBV220和pET22b中,获得了高表达。经破菌、阳离子交换层析、反相层析纯化获得了纯度大于95%的纯品。N端测序、质谱分析结果表明重组hPTH 结果完整,N端无Met或fMet。生物活性试验证明重组hPTH具有激活腺苷酸环化酶、增加骨质量和骨密度等作用。     

抗噬菌体工程菌的筛选

噬菌体污染常引起溶菌,造成人力物力浪费。应用自发突变的原理成功地从溶菌液中筛选到抗噬菌体的工程菌株;在发酵罐中培养,该菌株生长行为和表达水平没有变化。     

鼠羧肽酶原B在毕赤酵母中的表达、纯化与鉴定

为了在毕赤酵母中表达鼠羧肽酶原B(procarboxypeptidaseB,proCPB)蛋白,以RT-PCR法从SD鼠胰腺细胞中克隆了proCPB基因,将其插入pPIC9载体,PEG1000介导转入毕赤酵母GS115细胞,在甲醇的诱导下,实现了proCPB在毕赤酵母中的成功表达。通过发酵条件的优化,使用BMGY(pH6·0)培养基,添加0·5%的酪蛋白水解物,于28℃,在起始OD600达10·0时,每隔12h补加0·5%的甲醇,重组酵母GS115-proCPB表达的产物量可达到最高(500mg/L),表达时间可达120h,表达的目的蛋白占总蛋白的94%以上。通过纯化条件的优化,采用两步疏水层析,可使目的蛋白的纯度达96%以上,蛋白得率达38%,重组proCPB活化后所得CPB的比活力可达110u/mg(CPB标准品为180u/mg)。相对分子量测定表明重组蛋白的分子量与理论值极相近,N-端氨基酸测序进一步表明proCPB基因在毕赤酵母中得到了正确的表达和翻译后加工修饰。     

SARS病毒S蛋白片段的克隆表达和纯化

以大肠杆菌表达载体pET22b为载体,直接表达SARS病毒S蛋白425-569及894-1033等2片段。表达所获得的包涵体形式蛋白经尿素溶解后分别经过2次离子交换层析,获得初步纯化。在酸性和低尿素浓度环境中,2种S蛋白片段极易沉淀。Western印迹鉴定显示其与抗SARS病毒血清呈阳性反应。获得的纯化蛋白可用于检验受体结合能力等研究。     

单克隆抗体纯化过程中内毒素去除方法分析

目的：分析单克隆抗体纯化过程中,去除内毒素的不同方法的应用效果,并探讨它们应用于中试规模的可行性。方法与结果：比较了多聚赖氨酸型的内毒素去除填料、20nm膜过滤、将单抗附着在蛋白A柱上后使用精氨酸和组氨酸溶液冲洗等3种方法的内毒素去除效果,发现3种方法都可以将内毒素水平大幅降低,可分别将内毒素去除70％、88％和97％。因为单抗分子等电点较高,所获得的最低内毒素含量为0．2～0-3EU／mg。结论：3种方法均具有一定的工艺放大潜力,进一步提高内毒素去除效果将需要综合使用不同机理的去除技术。     

重组低出血抗凝蛋白在毕赤酵母中的中试发酵工艺研究及其纯化与鉴定

目的:通过对毕赤酵母中试发酵工艺的改进,建立一种简便可行的重组低出血抗凝蛋白(EH)的中试发酵工艺,为EH蛋白的放大生产研究奠定基础。方法:首先通过摇瓶培养绘测毕赤酵母工程菌的生长曲线,然后根据生长曲线,将对数生长期的菌种经过两级摇瓶培养放大后,直接接种到500 L的发酵罐中放大培养,通过发酵液的D600nm值、溶氧值(DO2)及菌体湿重动态监测细菌的生长状态,并用流加甲醇的方法诱导表达目的蛋白;表达上清经超滤、两步离子交换层析纯化获得目的蛋白;用非还原型SDS-PAGE和HPLC检测目的蛋白的纯度;用SDS-PAGE和质谱方法分析目的蛋白的相对分子质量;用Western印迹验证目的蛋白;用凝块法检测目的蛋白的抗凝活性。结果:发酵结束时,上清中蛋白含量达1.41 g/L,经后期分离纯化,得到约21 g EH蛋白,SDS-PAGE分析可见EH蛋白在还原状态下表观相对分子质量约为13.2×103±0.2×103,质谱分析相对分子质量约为7.3×103±0.73×103;Western印迹表明检测条带为目的蛋白,能被抗水蛭素抗体特异性结合;非还原型SDS-PAGE和HPLC测得EH蛋白的纯度均高于95%;凝块法检测EH蛋白的抗凝比活性为512~1024 ATU/mg。结论:建立了一条简便可行的EH蛋白的中试放大发酵生产工艺。     

霍乱毒素B亚单位与谷氨酸脱羧酶抗原表位肽融合蛋白的表达及鉴定

目的:在大肠杆菌中表达霍乱毒素B单位(CTB)与谷氨酸脱羧酶(GAD)抗原表位肽段(531～545)的融合蛋白。方法:通过PCR技术将CTB基因与GAD基因融合在一起,插入pET22b载体,转化大肠杆菌BL21(DE3)后经诱导获得融合基因的表达;对表达产物进行包涵体复性后,纯化得到融合蛋白分子;对该融合蛋白分子进行了Western印迹和GM1-ELISA分析。结果:表达的融合蛋白的相对分子质量约为14000,Western印迹表明该融合蛋白具有霍乱毒素抗原性;GM1-ELISA实验表明该融合蛋白能够特异性地结合神经节苷酯GM1,表明该蛋白具有与CTB相似的五聚体结构。结论:融合蛋白CTB-GAD的成功表达,为后续动物实验提供了充足的抗原。     

炭疽杆菌噬菌体裂解酶基因在大肠杆菌中的表达及鉴定

利用PCR方法扩增炭疽杆菌噬菌体裂解酶 (γlysin)基因 ,克隆至大肠杆菌表达载体pET2 2b中 ,经菌落PCR筛选、序列测定和酶切鉴定证实表达载体pET22b-γlysin构建成功 ,并在EscherichiacoliBL21(DE3)中获得了高表达。目的蛋白约占菌体总蛋白的40% ,5L发酵罐中的产酶水平高达 15g L。菌体经超声破碎 ,制备无细胞抽提液 ,StreamlineSP和SPHP柱层析以及SephacrylS-100凝胶过滤三步纯化 ,得到分子量为 2 7kD单一条带的目的蛋白 ,薄层扫描分析显示其纯度大于 95 %。目的蛋白的收率为19.1% ,纯化倍数为350。生物活性鉴定重组的γ噬菌体裂解酶具有特异性 :可快速裂解炭疽杆菌 ,比活为 1400u mg左右 ;而对大肠杆菌、枯草杆菌及蜡样芽孢杆菌没有裂解活性。     

干扰素与转铁蛋白融合蛋白在毕赤酵母中的表达及鉴定

利用重叠 PCR 技术将干扰素 (interferon , IFN) 基因与转铁蛋白 N 端半分子 (transferrin N-terminal half-molecule , TFN) 基因在体外融合,融合基因和单独的 TFN 基因分别克隆至真核表达载体 pPIC9 中,转化毕赤酵母 GS115 ,得到的转化子经诱导表达后在发酵上清中均获得了表达 . 经 SP Sepharose Fast Flow 阳离子交换层析、 Phenyl Sepharose Fast Flow 疏水层析纯化,获得了纯度大于 93 ％的重组融合蛋白 IFN-TFN 和纯度大于 95 ％的重组 TFN 样品 . 生物活性实验证明融合蛋白 IFN-TFN 具有抗病毒活性 . 铁饱和实验证明融合蛋白 IFN-TFN 和单独的 TFN 具有相同的铁结合能力 . 因而 TFN 可望作为 IFN 的天然运输载体 .     

大肠杆菌Nα-乙酰转移酶RimLE的表达、纯化及活性测定

目的:在体外鉴定大肠杆菌Nα-乙酰转移酶RimL(RimLE)的功能。RimL可以通过将原核生物的核糖体蛋白L12的N端氨基乙酰化,使其转化成L7。方法:通过PCR从大肠杆菌基因组中钓取RimLE和L12/L7E的基因,将其插入pET系统,转化大肠杆菌BL21(DE3),培养后提取、纯化得到RimLE和L12E。结果:RimLE在体外可将L12E的N端氨基乙酰化,最大反应速率为25.63/min。结论:为研究原核生物中Nα-乙酰化的分子机制及其功能奠定了基础。