小鼠休眠胚胎与正常胚胎冻融后体内外发育潜力的比较

目的检验小鼠休眠胚胎冻融后的质量及体内外发育潜力,为胚胎休眠技术的生产应用提供必要的参考。方法采用常规冷冻方法将正常孵化期胚胎和休眠胚胎进行冷冻,之后分别进行体外复苏培养实验和胚胎移植实验。随后利用双重荧光染色的方法分别对冻融前后的小鼠休眠胚胎与正常孵化期胚胎进行细胞计数,观察两种胚胎冻融前后的质量变化。结果休眠胚胎的冷冻解冻回收率、发育率均极显著高于孵化期胚胎(72.1%vs 50.2%,P<0.01;94.2%vs 73.9%,P<0.01)。休眠胚胎的移植妊娠率显著高于孵化期胚胎(40.8%vs 30.1%,P<0.05)。休眠胚胎的内细胞团细胞数显著高于孵化期胚胎(27.83 vs 19.53,P<0.05),滋养层细胞数差异不显著。冻融培养后休眠胚胎的内细胞团数,滋养层细胞数均显著高于孵化期胚胎(25.18 vs 14.68,P<0.05;114.09 vs 73.88,P<0.05)。结论小鼠休眠胚胎冻融后胚胎质量及体内外发育潜力均优于小鼠正常孵化期胚胎。     

饲喂雌鼠大豆异黄酮对后代雌性生殖性状的影响

目的研究雌性小鼠饲喂异黄酮后对其后代雌鼠生殖性状的影响。方法分别在雌鼠从断奶到妊娠前和妊娠期间两个不同阶段的日粮中添加不同剂量的大豆异黄酮（0、50、400 mg/kg）。记录F1代的出生窝产仔数、出生窝重、雌鼠的阴道最早开张时间和最早见栓时间,以及后代雌鼠性成熟期和体成熟期生殖器官重量、血清雌激素的含量。结果雌鼠妊娠期饲喂含50、400 mg/kg大豆异黄酮的饲料后F1代的窝产仔数显著高于对照组（P〈0.05）;雌鼠妊娠期采食400 mg/kg大豆异黄酮饲料,其后代雌鼠初次配种时间明显延迟（P〈0.05）;45、65日龄体重显著低于对照组,65日龄子宫重显著低于对照组,卵巢重显著高于对照组;血清中雌激素含量显著低于对照组（P〈0.05）,妊娠期间采食50 mg/kg大豆异黄酮饲料,其F1代雌鼠仅窝产仔数和45日龄时血清中雌激素含量受到影响;而雌鼠从断奶到怀孕期间饲喂含大豆异黄酮饲料的F1代在各项指标与对照组均差异无显著性。结论雌鼠妊娠期间饲喂含400 mg/kg大豆异黄酮的饲料会显著影响其雌性后代的初情期、生殖器官发育、血清雌激素含量等生殖生理性状,而在非妊娠期饲喂含大豆异黄酮饲料对F1代无显著影响。     

雌、孕激素对牛子宫内膜上皮细胞αvβ3体外诱导差异表达的影响

目的 研究体外培养的牛子宫上皮细胞内整合素αvβ3基因诱导差异表达的变化,以期为探究牛子宫容受态的标志蛋白提供参考。方法 运用RT-PCR方法分析不同浓度雌激素、孕激素以及雌、孕激素协同作用对牛子宫内膜上皮细胞中整合素αvβ3的诱导表达变化情况。结果 单独添加孕激素10~(-7)mg/mL时,整合素αvβ3表达量均最高,10~(-7)mg/mL组内αv和β3的表达量均显著高于对照组(P0.05)。单独添加雌激素10~(-10)mg/mL组,αv的表达量最高,而β3的表达量最低。协同添加雌、孕激素组中,整合素αvβ3的表达量均高于对照组,其中αv的表达量显著高于对照组(P0.05);β3的表达量与对照组相比差异不显著(P0.05)。结论 单独添加孕激素和协同使用雌、孕激素时,均可以促进牛子宫内膜上皮细胞中整合素αvβ3的mRNA表达量上升;单独添加雌激素的作用则与之相反。由此,整合素αvβ3在“种植窗”期的牛子宫内膜上皮中可作为一个潜在的子宫容受态参考标志基因。     

雌二醇和孕酮对小鼠卵母细胞体外成熟的影响

目的研究雌二醇（E2）、孕酮（P4）对昆明小鼠卵母细胞体外成熟的影响。方法小鼠经注射孕马血清促性腺激素（PMSG）后48 h,摘取卵巢获得未成熟卵母细胞,分别在单独含不同浓度的E2或P4的成熟液中,或在同时含有不同浓度E2和P4的成熟液中,进行体外成熟,并对经过E2和P4处理成熟的卵母细胞进行体外受精。结果经15-16 h的成熟培养,各E2处理组的卵母细胞第一极体排出率虽然均略高于对照组,但它们之间无显著差异;各组卵母细胞体外受精48 h后,1000 ng/mL E2处理组的卵裂率显著低于其他各处理组和对照组,但各组的囊胚率之间无显著差异。各P4处理组的极体率和卵裂率,与对照组相比无显著差异,但是各处理组的囊胚率均极显著低于与对照组;两种激素协同处理组中[1000 ng/mL E2＋1000 ng/mL P4]组的极体率显著高于其他各处理组;而与对照组的极体率差异不显著。结论P4对小鼠卵母细胞的后期发育能力有一定的抑制作用,而E2却对小鼠卵母细胞的成熟及其发育潜力无明显作用。     

利用超数排卵方法高效获取小鼠休眠胚胎

目的为提高小鼠休眠胚胎的制备效率,尝试用超数排卵方法获取小鼠休眠胚胎。方法超排小鼠在注射孕马血清促性腺激素(PMSG)后,按照是否注射抗孕马血清(anti-PMSG serum或A-PMSG)以及注射的不同时间分为5组:在母鼠合笼前注射A-PMSG、在母鼠见栓后注射A-PMSG、在见栓第四天卵巢摘除手术后注射A-PMSG、不注射A-PMSG的超排组和不超排组。结果见栓后注射抗PMSG组的平均出胚数(9.4枚/只)最高,显著高于其他实验组。结论常规超排处理结合注射抗PMSG血清法能有效提高小鼠休眠胚胎的回收率。     

Oct4基因在猪孤雌激活和体外受精早期胚胎中的表达特征

目的研究植入前胚胎发育重要基因Oct4在猪孤雌和体外受精胚胎中的表达特征。方法收集成熟卵母细胞、孤雌和体外受精2细胞、4细胞、8细胞胚胎和囊胚,做荧光即时定量PCR检测,以体外成熟的猪卵母细胞做对照分析相对表达量。结果孤雌组和体外受精组胚胎在8细胞期Oct4表达量均最高(P<0.05),在孤雌和体外受精组囊胚相对于其他时期Oct4表达量最低(P<0.05)。在同一时期孤雌和体外受精胚胎上Oct4表达并没有差异。结论多能性基因Oct4在卵裂发育时期表达量动态变化,孤雌胚胎在一定程度上可作为体外胚胎基因表达的模型,且不同的胚胎培养条件可能导致基因表达的差异。     

经程序化冷冻的小鼠休眠胚胎的基因表达谱差异分析

目的探讨小鼠休眠胚胎经程序化冷冻后基因表达谱的变化及相关信号通路的改变趋势。方法采用Affymetrix基因芯片检测小鼠正常休眠胚胎和经程序化冷冻后的休眠胚胎的差异表达基因;采用GO分析和Pathway分析等生物信息学方法进一步了解相关信号通路的改变。结果经程序化冷冻后的小鼠休眠胚胎与正常休眠胚胎相比,存在228个差异表达基因,其中50个基因表达上调,178个基因表达下调。Pathway分析显示黏着斑通路、细胞外基质受体相互作用通路、肌动蛋白细胞骨架调节通路、细胞凋亡通路、细胞通讯通路、泛素介导的蛋白质水解通路、甘油磷脂代谢通路、小细胞肺癌通路、TGF-β信号通路、MAPK信号通路等基因差异表达变化趋势明显。结论小鼠休眠胚胎经程序化冷冻后会导致一系列基因调控变化,并可能影响多条信号通路的协同变化。     

ICR胎鼠成纤维细胞培养方法的优化

目的确定胎鼠成纤维细胞（mouse embryonic fibroblasts,MEF）最优制备方法,为MEF的制备节省时间与原材料。方法取胎鼠组织,采用组织块培养法、胰酶消化培养法、胰酶消后组织块培养法进行分离培养MEF,比较观察MEF纯度、生长速度、细胞形态等指标,筛选最节省时间与原料的一种培养方法。结果组织块培养法所得MEF生长速度慢,细胞体积小,杂细胞少,纯化所需传代次数少。胰酶消化培养法的MEF生长速度快,体积较大,杂细胞数量多,纯化所需传代次数较多。胰酶消化后组织块培养法的消化后组织块的成纤维细胞生长速度介于前两种方法之间,细胞体积和形态与组织块法培养结果相似,杂细胞数量较少,纯化所需传代次数少。结论胰酶消化结合组织块培养法能最大限度的利用材料,在短时间内可制备大量MEF,满足核移植试验与作为饲养层细胞的需求。因此,胰酶消化结合组织块培养法是MEF最优培养方法。     

冻融后小鼠休眠胚胎超微结构的变化

目的从亚细胞超微结构的角度揭示其抗冻能力优于正常孵化胚胎的原因。方法利用透射电子显微镜观察小鼠休眠胚胎与正常孵化期胚胎在细胞连接和各细胞器形态与分布上的差异,以及冻融培养后的变化,并进行相关比较分析。结果通过亚细胞结构对比分析发现:冷冻前小鼠休眠胚胎为紧缩状,处于能量代谢较低的"基态",通过冻融后培养,细胞器结构恢复与正常孵化胚胎冷冻前相似;而正常孵化胚胎经过冻融后,线粒体数量减少,细胞核松散,异染色质增多。结论小鼠休眠胚胎与正常孵化胚胎冻融后相比,其细胞状态更有利于物质储存及能量代谢,表明小鼠休眠胚胎从亚细胞超微结构的角度比其正常孵化胚胎更具抗冻性。     

自然发情与诱导发情小鼠子宫内膜中雌激素受体α表达的比较

目的从雌激素受体α(ERα)的角度探讨自然发情小鼠与诱导发情小鼠的子宫内膜上,雌激素受体α表达是否受内源雌激素的特异诱导而变化,两者之间是否存在差异。方法27只同日龄母鼠,根据处理方式的不同随机分为3个组:自然发情假孕组(对照组)、诱导发情处理假孕组和自然发情假孕第1天摘除卵巢组,3个组的小鼠在见栓后第4、6、8天分别取样后,采用免疫组织化学法观察小鼠子宫内膜中雌激素受体α的表达情况。结果免疫组化结果显示,3个处理组的小鼠子宫内膜上皮细胞核、胞质都有ERα存在,且主要表达在腺上皮;见栓第4、6、8天时,诱导发情处理组小鼠子宫内膜的ERα阳性率均显著高于自然发情组和自然发情第1天摘除卵巢组(P0.05);见栓第8天时,自然发情处理组小鼠子宫内膜中的ERα阳性率与自然发情第1天摘除卵巢组差异不显著(P0.05),但见栓第4、6天时两者阳性率差异显著,自然发情处理组小鼠子宫内膜中的ERα阳性率显著高于自然发情第1天摘除卵巢组(P0.05)。结论诱导发情处理的小鼠子宫内膜,其表面雌激素受体α表达显著高于自然发情小鼠,且两者都受其内源性雌激素的特异诱导而变化。