结核疫苗保护力评价用感染菌液的制备和保藏研究

实验研究中对结合分枝杆菌感染菌液进行活菌数量与毒力的稳定性观察。以活菌计数与感染豚鼠后的肝、脾、肺病变指数为评判指标进行观察,结果显示低温保藏菌液在32个月内,其活菌数量处于6.7～18×105CFU/ml之间,感染豚鼠的肝、脾、肺病变指数处于42～51之间。说明低温保藏菌液具有很好的稳定性,可作为结核分枝杆菌感染豚鼠模型标准化用菌液。     

耐药结核分枝杆菌潜伏-复发感染动物模型的研究进展

潜伏结核感染(latent tuberculosis infection,LTBI)复发是新发结核病的主要来源,其中耐药结核病所占比例较大,使耐药LTBI复发的防控成为结核病研究的重点。耐药结核分枝杆菌潜伏-复发感染动物模型是开展耐药结核病防控相关机制研究、抗耐药结核分枝杆菌药物和疫苗研究的基础。目前耐药结核分枝杆菌感染动物模型缺乏,而已有的结核分枝杆菌标准株H37Rv潜伏-复发感染模型存在缺陷,如小鼠模型的潜伏期荷菌量偏高、复发期变异大,而猴模型的潜伏期和复发期不可预测。模型的可控性差使其应用困难,且缺乏可用的免疫学评价指标,导致远期复发无法预测。因此,基于现有H37Rv潜伏-复发感染动物模型的制备方法,展望耐药结核分枝杆菌潜伏-复发感染动物模型可能存在的缺陷,通过选用新的抑菌剂和诱导剂,制备有稳定潜伏期、潜伏时长适中、复发起点和复发水平变异小的动物模型,是未来耐药结核分枝杆菌潜伏-复发感染动物模型研究的方向。     

分枝杆菌制剂对小鼠的免疫调节作用的初步研究

探讨不同分枝杆菌制剂对小鼠的免疫调节作用。将C57BL/6小鼠,随机分成4组分别注射生理盐水、微黄分枝杆菌、草分枝杆菌和田鼠分枝杆菌制剂,每隔2周免疫一次。免疫2次后,小鼠取脾淋巴细胞体外培养,分别以PPD、PPDB刺激,用MTT法检测T淋巴细胞增殖情况;用酶联免疫斑点法(Enzyme-Linked ImmunoSpot assay,ELISpot)检测脾细胞分泌IFN-γ情况,分析各分枝杆菌制剂对小鼠免疫应答的影响。结果显示,与对照组相比,微黄分枝杆菌制剂和草分枝杆菌制剂免疫小鼠的T淋巴细胞增殖反应和脾细胞分泌IFN-γ均明显提高,其中微黄分枝杆菌组与对照组相比有显著性差异(p<0.01)。分枝杆菌制剂可促进小鼠免疫应答。     

豚鼠模型中结核菌素纯蛋白衍生物量效关系比较研究

目的在不同分枝杆菌致敏豚鼠模型中研究结核菌素纯蛋白衍生物(purified protein derivative of tuberculin,TB-PPD)的量效关系。方法将受试豚鼠随机分成6组:结核分枝杆菌H37Rv活菌致敏组、结核分枝杆菌临床株CMCC 94757、94754、94766致敏组、卡介苗(Bacillus Calmette-Guérin vaccine,BCG)致敏组和灭活结核分枝杆菌H37Rv致敏组。各组豚鼠分别于左侧大腿腹股沟皮下注射相应致敏原,5~6周后,所有豚鼠于脊柱两侧皮内注射20 IU/m L TB-PPD和50 IU/m L TB-PPD各0.1 m L;于注射后24 h、48 h观察和记录局部硬结的纵径与横径,计算平均值。结果所有组别豚鼠接受两种规格TB-PPD皮试后,无论是24 h还是48 h,局部硬结反应直径均大于10 mm,全部阳性,阳转率均为100%。5 IU TB-PPD皮试反应强度高于2 IU TB-PPD,存在明显的剂量效应关系。其中,24 h结果显示:2 IU TB-PPD和5 IU TB-PPD在H37Rv活菌致敏组、94766致敏组、灭活H37Rv致敏组皮试反应大小差异无统计学意义(t=2.291、P=0.071;t=2.722、P=0.053;t=1.76、P=0.153),其余3组5 IU TB-PPD皮试反应强度高于2 IU TB-PPD,差异均有统计学意义(t=4.098、P=0.015;t=4.811、P=0.009;t=3.068、P=0.037)。48 h硬结反应和24 h、48 h平均硬结反应结果均显示:在各致敏组豚鼠模型中5 IU TB-PPD皮试反应强度均高于2 IU TB-PPD,皮试反应大小均有统计学差异(t=3.471、P=0.018;t=3.371、P=0.020;t=6.216、P=0.003;t=5.244、P=0.006;t=3.959、P=0.017;t=4.674、P=0.010;t=4.824、P=0.008;t=3.794、P=0.019;t=3.857、P=0.018;t=2.86、P=0.046;t=3.539、P=0.024;t=3.365、P=0.028)。结论各组豚鼠致敏模型中5 IU TB-PPD的效价均明显高于2 IU TB-PPD,存在较为明显的量效关系。各种感染状态下,虽然高剂量制品可诱导更强的迟发型超敏(delayed type hypersensitivity,DTH)反应,但低剂量制品也不影响其阳性检出率。     

抗生素联合卡介苗治疗结核病的动物模型评价

目的用豚鼠模型初步评价抗生素联合卡介苗治疗结核病的可行性。方法用高剂量Mtb皮下攻击豚鼠2周后,将重组ESAT6-CFP10(EC)变态反应原皮试阳性的豚鼠随机分成4组:NS组、BCG组、抗生素组、抗生素+BCG组。抗生素+BCG组接受异烟肼(isoniazid,INH)和利福喷丁(rifapentine,RFT)的联合化疗,1次/周,共3次,给药结束后,每只豚鼠皮下免疫1/10人用剂量BCG;BCG组每只豚鼠仅皮下免疫1/10人用剂量BCG;抗生素组仅给药INH和RFT,1次/周,共3次;NS组给予生理盐水作为阴性对照。全部豚鼠于攻毒13周后安乐死解剖,评价肝、脾、肺的脏器综合病变指数,计算脾脏活菌载量(lg CFU),并对肝、脾、肺脏器做组织病理检查。结果 NS组、BCG组、抗生素组和抗生素+BCG组的脏器评分分别为83±8、81±10、45±28和33±14。其中,BCG组与NS组差异无统计学意义;抗生素组和抗生素+BCG组与NS组差异均有统计学意义(分别q=6.84,P0.001;q=9.02,P0.001),两组与BCG组比较,差异也均有统计学意义(q=6.44,P0.001;q=8.63,P0.001);但抗生素组与抗生素+BCG组差异无统计学意义。抗生素+BCG组豚鼠的脾脏活菌载量为(3.62±1.13)lg CFU,与NS组的(4.92±0.52)lg CFU和BCG组的(5.20±0.43)lg CFU比较,差异均有统计学意义(q=5.54,P0.01;q=6.72,P0.001)。抗生素组脾脏活菌载量为(4.39±0.50)lg CFU,与其他各组的差异均无统计学意义。病理组织切片显示各组病变程度由重到轻依次为BCG组NS组抗生素+BCG组≈抗生素组。结论化疗后免疫1针BCG的治疗效果较差,多针次的BCG免疫效果还需进一步研究。     

分枝杆菌制剂对小鼠细胞免疫功能影响的研究

以迟发性超敏反应与T淋巴细胞增殖反应分别作为体内,外细胞免疫功能的基本参数,探讨不同剂量的分枝杆菌,在不同时间对小鼠细胞免疫功能的影响。结果 显示免疫组的中和／或高剂量组的反应显著强于对照组（P＜0．05）,且随时间延长,剂量加大有增强的趋势。证实分枝杆菌制剂能增强机体细胞免疫功能。     

Poly I∶C联合BCG-CpG复合佐剂对结核亚单位疫苗免疫效果的影响

目的探讨聚肌胞苷酸(Poly I∶C)联合BCG-CpG复合佐剂(BCG-CpG-DNA+Al,简称BC02)对结核亚单位疫苗的免疫效果是否有增强作用。方法 BALB/c小鼠分成5组,3组分别免疫含有不同剂量poly I∶C(10、25、50μg/剂)的结核亚单位疫苗(Ag85b+ESAT6-CFP10)/(BC02+poly I∶C)3针,间隔10 d;2组分别免疫PBS或(Ag85b+ESAT6-CFP10)/BC02作为对照。末次免疫后第7 d,分离脾淋巴细胞,进行抗原特异性的IFN-γELISPOT检测、ELISA检测和淋巴细胞增殖检测以评价细胞免疫应答。豚鼠分成4组,1组免疫含有50μg poly I∶C/剂的新亚单位疫苗(Ag85b+ESAT6-CFP10)/(BC02+poly I∶C)3针,间隔10 d;3组分别免疫(Ag85b+ESAT6-CFP10)/BC02疫苗、生理盐水和BCG作为对照。末次免疫30 d后,每只豚鼠皮下攻击250 CFU结核分枝杆菌。41 d后,解剖豚鼠,进行肝、脾、肺脏器综合病变评分和脾菌计数以评价保护力。结果含不同剂量poly I∶C的(Ag85b+ESAT6-CFP10)/(BC02+poly I∶C)疫苗免疫组小鼠的脾淋巴细胞分别经Ag85b和ESAT6-CFP10多肽刺激后,分泌IFN-γ的抗原特异性T细胞频数、IFN-γ分泌量和细胞增殖指数均较(Ag85b+ESAT6-CFP10)/(BC02)组大幅度提高,且应答强度与poly I∶C呈现较为明显的量效关系。(Ag85b+ESAT6-CFP10)/(BC02+poly I∶C)组豚鼠脏器综合病变指数(27.5±20.4)和脾菌分离数[(4.22±0.59)log10CFU]均低于(Ag85b+ESAT6-CFP10)/BC02组[35.8±27.3,(5.19±0.66)log10CFU],其中脾菌分离数的差异有显著统计学意义(P=0.003 0)。结论 Poly I∶C佐剂对结核亚单位疫苗(Ag85b+ESAT6-CFP10)/BC02诱导的细胞免疫应答和抗结核保护力均有一定的增强效果。