超活性胰高血糖素的分泌表达

通过多肽化学合成方法 ,人们对胰高血糖素的结构与功能关系有了比较深刻的了解 ,其中最引人注目的成就之一是发现 [Lys17,18,Glu2 1] 胰高血糖素具有比天然胰高血糖素更高的生物活性 ,称之为超活性胰高血糖素(superactiveglucagon ,下称SA glucagon)。为了通过基因工程途径获得SA glucagon ,用PCR方法从以前构建的胰高血糖素表达载体pAGluT得到SA glucagon的基因 (SAG) ,构建了含PL 启动子 ,phoA信号肽和SAG的分泌表达载体pBLSG7。pBLSG7转化到大肠杆菌BL2 1中 ,进行SAG的分泌表达 ,在摇瓶条件下 ,该菌种能分泌表达SA glucagon达 3.6 5mg/L(A60 0 =1) ,占上清液中蛋白质的 19.5 % ,并进一步研究了诱导温度和菌株对表达的影响。     

胰高血糖素在大肠杆菌中的分泌表达

报道了用基因工程方法构建含phoA(碱性磷酸酯酶)启动子、phoA信号肽与胰高血糖素基因的表达载体pAGluT.实验证明,转化了pAGluT的大肠杆菌(E.coli YK537)可高水平地分泌表达胰高血糖素,其表达量为80 mg/L.phoA表达系统分泌表达的胰高血糖素的物化性质与天然胰高血糖素相同,并具有相同的生物活性.这一结果不仅为基因工程生产胰高血糖素打下基础,亦为研制胰高血糖素的拮抗剂以及其他多肽的基因工程研究提供了新的思路.     

僵蚕药材蛋白质分级指纹图谱建立及产地鉴定相关分子研究

建立云南与四川僵蚕药材的总蛋白质指纹图谱及分级指纹图谱,对比分析以发现其中的差异表达蛋白质分子并进行鉴定及生物信息学分析,探索其用于产地鉴定的可行性。提取两种僵蚕的酸溶、碱溶、水溶及醇溶性总蛋白质,对其进行丙酮分级沉淀,对所得样品进行SDS-PAGE指纹图谱对比分析,对所得差异条带进行LC-MS/MS分析,数据库检索后进行生物信息学分析。两种僵蚕的总蛋白质指纹图谱相似度很高,难以据此进行产地鉴定;两种僵蚕的分级指纹图谱则有较显著差异,有望用于产地鉴定;依据分级指纹图谱差异共鉴定出β-葡萄糖苷酶、抗胰凝乳蛋白酶、抗胰蛋白酶、含脂肪酶结构域蛋白等273种蛋白质。云南与四川僵蚕的蛋白质组成及其分级指纹图谱存在显著差异,有望用作产地鉴定的分子依据;醇溶蛋白质构建分级指纹图谱可以提供更加丰富的信息及更好的分辨率;分级指纹图谱技术具有简便易行、分辨率较高的优点,为其他中药材的产地鉴定研究提供了方法学思路。     

PCR方法扩增神经生长因子β亚基基因的条件优化

研究了不同退火温度、dNTP浓度、Mg2+浓度下用PCR方法扩增小鼠神经生长因子β亚基(β-NGF)基因的效率.并将扩增所得β-NGF基因克隆到pUCAT4载体中,对得到的阳性克隆进行了测序证实,为下一步利用该基因表达重组β-NGF创造了前提条件.     

肿瘤饥饿疗法的新靶标——内分泌腺衍生血管内皮生长因子

“肿瘤饥饿疗法”是通过抑制促肿瘤血管新生细胞因子的作用,阻断肿瘤血管形成,最终实现“饿死”肿瘤细胞的一种治疗方法．内分泌腺衍生血管内皮生长因子(EG-VEGF)是在2001年被发现的一个组织选择性促血管新生因子．近年来的研究表明,EG-VEGF还兼有促进造血干细胞分化、刺激胃肠道收缩及影响肠神经系统发育等多种生理功能．EG-VEGF的异常表达与多种肿瘤及血管新生依赖性疾病的发生发展密切相关,有望作为相应的治疗靶点开发诊断及治疗试剂．本文对有关研究进展及应用前景作一简要综述．     

中药材资源质量评价方法的研究进展

中药材资源是中医药的物质基础,其质量事关临床用药的安全性与有效性,其科学评价是中药产业现代化、标准化以及国际化的前提条件。中药材的性状特征、药效成分以及分子标记为迄今三类质量评价方法的主要依据。近年来,微性状鉴定及仿生识别技术的应用显著提高了基于性状特征评价中药材质量的准确性与客观性;中药指纹图谱、代谢组学技术与化学计量学的应用极大地促进了基于药效成分评价中药材质量的科学性及相应有效成分群的发现;基因组学及蛋白质组学的进展推动了分子标记的挖掘及相应分子鉴定技术的建立。上述方法学进展为中药材质量标准体系的建设和中药材资源的开发利用提供思路与借鉴。     

响应面分析法优化重组原动蛋白2β诱导条件的研究

原动蛋白2β(PK2β)是近年新发现的一个选择性激活PKR1的蛋白质因子。采用响应面分析法(RSM)研究了利用重组BL21(DE3)表达PK2β的最优诱导条件。结果表明,诱导时机与诱导物浓度对PK2β的表达水平具有显著性影响,但诱导时间不具有显著性影响。试验数据拟合与极值分析表明最优诱导条件为工程菌OD600为0.50时,采用终浓度为0.11 mmol/L的IPTG在37℃诱导培养7.73 h,此时PK2β表达水平可达242.78 mg/L。验证试验结果表明,重组PK2β的表达水平比优化前提高了46%,而IPTG的用量减少了89%,有利于大量制备该蛋白质进行后续功能研究及应用研究。     

提高重组原动蛋白2表达水平的优化策略

原动蛋白2(PK2)是近年发现的一个具有多种生物学功能的蛋白质因子。采用Design-Expert 7.0.0软件对重组PK2表达的最优诱导条件进行响应面分析。结果表明,诱导起始时机与诱导物浓度是影响重组PK2表达水平的显著性因子。同时,诱导时间-诱导时机、诱导时机-诱导物浓度之间的相互作用对PK2的表达水平具有显著性影响。试验数据拟合与极值分析表明最优诱导条件为:工程菌OD600为0.60时,采用终浓度为0.62 mmol/L的IPTG在37℃诱导培养2.82 h,此时重组PK2的表达水平为170.73 mg/L。优化后的诱导条件导致重组PK2的表达水平提高了51.1%,而所需IPTG减少38.0%,诱导时间缩短53.0%,有利于大量制备重组PK2进行后续功能研究及应用研究。     

Secretion expression of recombinant glucagon in Escherichia coli

A novel approach for the preparation of recombinant human glucagon was described. An expression vector pAGluT, containing phoA promoter, phoA signal peptide and glucagon gene, was constructed by means of genetic engineering. Escherichia coli strain YK537 was transformed with pAGluT. High-level secretory expression of recombinant human glucagon was achieved. The expression yield of recombinant human glucagon was found to be 80 mg/L, approximately 30% of the total proteins in supernatant. The biological activities and the physicochemical properties of the purified recombinant human glucagon were found to be the same as that of native glucagon. In addition, our results suggested that phoA expression system may be suitable for the expression of other small peptides.     

僵蚕药材酸溶性蛋白质的分离提取及鉴定

以Box-Behnken组合设计进行僵蚕药材酸法提取工艺的响应面优化,并对提取物中蛋白质进行定性定量分析。结果表明:酸法工艺获取僵蚕蛋白质的最佳条件为提取温度31. 8℃、提取时间3. 0 h、液料比49. 6∶1(V∶m)、醋酸钠缓冲液浓度0. 12 mol/L,此时蛋白质提取率为5. 34%。十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)指纹图谱结果表明,僵蚕酸溶性蛋白质主要分布于26 390～31 570和59 130～81 790区间,其中31 570与27 870蛋白约占总蛋白的59. 9%,71 700与81 790蛋白约占总蛋白的24. 3%。傅里叶变换红外吸收光谱(FTIR)结果表明,僵蚕酸溶性蛋白质具有特征性指纹图谱。上述结果有望用做僵蚕药材分子鉴定的依据,有助于僵蚕资源的开发利用。