僵蚕药材蛋白质分级指纹图谱建立及产地鉴定相关分子研究

建立云南与四川僵蚕药材的总蛋白质指纹图谱及分级指纹图谱,对比分析以发现其中的差异表达蛋白质分子并进行鉴定及生物信息学分析,探索其用于产地鉴定的可行性。提取两种僵蚕的酸溶、碱溶、水溶及醇溶性总蛋白质,对其进行丙酮分级沉淀,对所得样品进行SDS-PAGE指纹图谱对比分析,对所得差异条带进行LC-MS/MS分析,数据库检索后进行生物信息学分析。两种僵蚕的总蛋白质指纹图谱相似度很高,难以据此进行产地鉴定;两种僵蚕的分级指纹图谱则有较显著差异,有望用于产地鉴定;依据分级指纹图谱差异共鉴定出β-葡萄糖苷酶、抗胰凝乳蛋白酶、抗胰蛋白酶、含脂肪酶结构域蛋白等273种蛋白质。云南与四川僵蚕的蛋白质组成及其分级指纹图谱存在显著差异,有望用作产地鉴定的分子依据;醇溶蛋白质构建分级指纹图谱可以提供更加丰富的信息及更好的分辨率;分级指纹图谱技术具有简便易行、分辨率较高的优点,为其他中药材的产地鉴定研究提供了方法学思路。     

白芷醇溶蛋白质提取工艺优化及其指纹图谱研究

目的：基于响应面设计优化白芷醇溶蛋白质提取工艺,并研究其指纹图谱特征。方法：首先考察液料比、提取时间、乙醇浓度、提取温度四个单因素对白芷醇溶蛋白质提取率的影响,再通过Box-Behnken方法对影响提取率的工艺因素进行响应面优化,最后对白芷及易混淆药材的醇溶蛋白质指纹图谱进行对比分析。结果：最佳提取工艺条件为：液料比13∶1(mL/g),提取时间8.75 h,乙醇浓度42%,提取温度45℃,在此条件下提取率为0.294%。SDS-PAGE分析表明白芷醇溶蛋白质样品分子量范围介于15～95 kDa,91.4 kDa与65.6 kDa分子为高丰度蛋白质。此外,白芷与天花粉、粉葛、山药的醇溶蛋白质指纹图谱有显著差异。结论：利用响应面法优化了白芷醇溶蛋白质的提取工艺,并建立其专属性SDS-PAGE指纹图谱,为其分子鉴定及资源开发提供实验依据。     

莲种子蛋白质提取方法比较与双向电泳分析

莲(Nelumbo nucifera Gaertn.)不仅是重要的水生蔬菜作物之一,而且是进行基础研究的好材料。本文采用4种蛋白质提取方法(新型TCA/丙酮法、传统TCA/丙酮法、改良的Tris-HCl法、Tris-饱和酚法)并结合双向电泳技术,对莲子蛋白质提取方法进行筛选与优化。双向电泳实验结果显示,所得蛋白质图谱与莲种子蛋白质组成分布特点一致。通过PDQuest软件分析表明,新型TCA/丙酮法适用于莲子叶和胚芽组织的双向电泳蛋白质提取,而传统TCA/丙酮法则适用于莲胚轴组织双向电泳的蛋白质提取。研究结果为进一步利用质谱进行莲子蛋白质组研究奠定了基础。     

响应面法优化水酶法提取辣木籽蛋白质的工艺及其功能性质研究

为了提取和利用辣木籽蛋白质,本文通过水酶法优化其提取条件,并探讨其功能性质。以辣木籽为原材料,以蛋白质提取率为指标,首先确定了最佳使用酶为Alcalase碱性蛋白酶,再通过单因素试验考察料液比、时间、温度、酶添加量和pH等因素对蛋白质提取率的影响,在此基础上,利用响应面试验设计优化水酶法提取辣木籽蛋白质的工艺。结果表明,最佳工艺条件为:使用Alcalase碱性蛋白酶,在料液比为1∶10,酶添加量为4.5%,pH为9.0,温度为60℃,时间为4.5 h,此时辣木籽蛋白质的提取率最高为68.23%。在pH为10、温度为55℃时辣木籽蛋白质的氮溶解指数最高;辣木籽蛋白质持水性随着pH的增加而增加,在温度为40℃时持水性最好;在温度为55℃时,辣木籽分离蛋白的吸油效果最明显。     

响应面法优化低温豆粕大豆分离蛋白提取工艺

采用响应面分析法(RSM)对低温豆粕大豆分离蛋白(soybean protein isolated,SPI)的碱提工艺进行优化。在单因素实验的基础上,选取了影响SPI提取率的4个关键因素(pH、温度、时间和液料比)进行四因素五水平的中心组合旋转实验设计(CCRD)。通过RSM建立了响应值(SPI提取率)与各影响因素之间的回归方程,并获得了SPI的最优提取条件:pH 8.5,提取温度55℃,提取时间42.8 min,料水比1∶9.7(g/mL),此条件下SPI提取率预测值为37.12%,与实验值(36.69%)的误差为1.16%。将一次碱提后残渣进行二次碱提,二次提取率为10.16%。2次碱提上清液等电点沉淀的蛋白沉淀率分别为84.03%和85.84%。     

化学模式识别结合HPLC指纹图谱的僵蚕质量评价研究

建立HPLC指纹图谱结合化学模式识别技术对僵蚕药材进行质量评价。采用Insertsil ODS-3(4.6 mm×250 mm,5μm)色谱柱,以乙腈-0.1%磷酸水溶液为流动相梯度洗脱,检测波长365 nm,流速0.8 mL/min,进样量10μL,柱温30℃。采用相似度评价、聚类分析、主成分分析等化学模式识别方法,对不同来源的20批僵蚕药材进行质量分析和评价。建立的指纹图谱标定了9个共有峰,指认了5个峰,1号峰为芦丁,2号峰为金丝桃苷,4号峰为紫云英苷,6号峰为槲皮素,7号峰为山奈酚,并将9个共有峰峰面积与其性状、总灰分、酸不溶性灰分、浸出物及白僵菌素含量进行相关性分析。结果表明本研究建立的僵蚕HPLC指纹图谱结合化学模式识别的方法可靠、易行,方法重复性好、专属性强,与药材性状、总灰分、浸出物及白僵菌素含量等质控指标均有一定的相关性,为后续僵蚕药材的质量控制提供依据和参考。     

响应面法优化灵芝菌丝体胞内灵芝酸的提取

利用单因子试验和响应面法优化了影响灵芝菌丝体灵芝酸的提取过程。基于3因素3水平的中心组合设计,得到了描述胞内灵芝酸提取得率与操作参数之间的二次响应面模型。在乙醇浓度为93.6%(v/v)、提取温度79.1℃、提取液固比42.2∶1、提取次数2次、每次提取时间2 h的条件下,最大灵芝酸理论提取得率为28.36 mg胞内灵芝酸每克干菌丝。模型优化条件下的实际灵芝酸提取得率(28.72 mg/g干菌丝)与理论灵芝酸提取得率(28.36 mg/g干菌丝)相符。     

醮核荔枝胚胎发育相关蛋白质的分离及初步鉴定

通过二维聚丙烯酰胺凝胶电泳以及计算机辅助的图像分析技术,对荔枝开花后40d的正常与败育胚蛋白质图谱进行初步分析。结果表明,100个蛋白质点在表达丰度上有明显差异;选择仅在正常发育胚胎胶上表达的蛋白点15个和仅在败育胚胎胶上表达的蛋白点50个,进行基质辅助激光解吸附电离飞行时间质谱（MALDI—TOFMASS）分析,鉴定出9个与胚发育相关的蛋白,这些蛋白可能参与了胚败育的调节和控制。     

鼠尾胶原蛋白提取、分离、纯化方法的建立及鉴定

目的建立一种高效提取、分离、纯化鼠尾胶原蛋白的方法。方法通过对鼠尾进行剥离获得鼠尾腱,用Tris-HCl缓冲液、胃蛋白酶处理获得鼠尾胶原蛋白原液、反复使用氯化钠溶液进行分级盐析、醋酸溶液复溶进行鼠尾胶原蛋白的纯化。超纯水透析除去无机盐类获得纯化的鼠尾胶原蛋白。通过SDS-PAGE蛋白质电泳、氨基酸含量分析等技术手段鉴定。结果本研究建立的方法可以获得高纯度的鼠尾胶原蛋白,纯度达到电泳纯。与国外进口的商业化鼠尾胶原蛋白产品相比无差异。研究了提取、分离、纯化参数对得率、纯度的影响,建立了最优的鼠尾胶原蛋白提取条件,胃蛋白酶用量：1∶500,酶解时间：72 h,盐析浓度：2 mol/L,提取所用酸溶液：0.05mol/L醋酸溶液。结论为鼠尾胶原蛋白的扩大化生产提供了合适的工艺参数,为大量获得鼠尾胶原蛋白并进行更深层次的功效方面研究提供了理论支持和实践基础。     

基于指纹图谱的Box-Benhnken响应面法结合BP神经网络多指标优化黑胡椒提取工艺CSCD

基于中药指纹图谱技术,采用Box-Benhnken响应面法结合BP神经网络优化黑胡椒的提取工艺。将黑胡椒HPLC指纹图谱总峰面积标准化值、胡椒碱峰面积归一化值、指纹图谱相似度分别赋以权重,得到综合评价指标。在单因素试验的基础上,应用Box-Benhnken响应面法优化黑胡椒提取工艺,最佳提取工艺为乙醇浓度90%、料液比1∶40(g/mL)、超声时间40 min。选取Box-Benhnken响应面法获得的综合评价指标进行BP神经网络训练、验证与预测,得到最佳提取工艺为乙醇浓度100%、料液比1∶30(g/mL)、超声时间为40 min。三组黑胡椒最优提取工艺验证结果证明,BP神经网络的综合评价指标为0.895,优于Box-Benhnken响应面法的综合评价指标0.885。本研究基于中药指纹图谱技术,采用Box-Benhnken响应面法结合BP神经网络,可为黑胡椒提取工艺的优化提供新思路,获取最佳提取方案。     

响应面法优化乌骨藤中白桦脂酸提取工艺

为优化乌骨藤(Marsdenia tenacissima)中白桦脂酸的提取工艺,在单因素实验的基础上,采用Box-Behnken中心组合设计方法,研究超声功率、提取时间、料液比及提取次数等因素及其交互作用对白桦脂酸提取率的影响。利用Design Expert 8.06软件对数据进行回归分析,得到二次多项式回归方程的预测模型,并通过响应曲面优化方法得到白桦脂酸最佳提取工艺。结果表明,乌骨藤中白桦脂酸的最佳提取工艺为超声功率150 W,提取时间20 min,料液比(g/mL)为1:25,提取2次,白桦脂酸提取率预测值为0.314%,验证值为0.311%。     

负压空化法提取五倍子单宁酸的响应面法优化

本文将负压空化提取与响应曲面设计相结合的方法应用于五倍子单宁酸的提取中,利用中心组合(Box-Behnken)实验设计原理研究了提取温度、液固比、提取时间3个自变量对响应值单宁酸提取得率的影响.结果表明,负压法提取五倍子单宁的最佳工艺条件为:提取温度55℃、液固比24∶1 (mL∶g)、提取时间30 min,在此条件下单宁酸提取率为66.56％,与模型预测值(67.353％)相对误差为1.18％＜5％,证明响应面回归方程的预测值与试验值之间具有较高的拟合度.     

响应曲面法优化马尾松中莽草酸的超声提取工艺

以马尾松松针为原料,采用超声波提取法从松针粉中提取莽草酸,通过考察料液比((VH2O∶m松针粉,mL:g)、提取时间、提取温度及超声波功率等因素对松针中总莽草酸含量的影响,并在单因素试验的基础上,选取料液比、提取时间、超声波功率3个变量,进行Box-Behnken中心组合设计优化,获得马尾松松针中莽草酸的最佳提取工艺参数为料液比1∶26,提取时间为46min,超声波功率为359 W,此条件下莽草酸的提取率为1.948%。     

琥珀酸放线杆菌发酵培养基的优化

对琥珀酸放线杆菌(Actinobacillus succinogenes)CGMCC1593发酵产生琥珀酸培养基的主要成分,及其含量进行优化。通过单因素试验,得出发酵培养基中葡萄糖、酵母膏和玉米浆的含量对产生琥珀酸有显著影响;采用响应面法(RSM),得出多元二次回归方程拟合的三种因素与琥珀酸含量间的函数关系,并根据优化结果与实验,CGMCC1593产琥珀酸达到41.69g/L。     

响应面法优化混合酶-超声波联合提取栀子黄色素工艺研究

以栀子为原料提取栀子黄色素,将混合酶-超声波技术相结合,对栀子黄色素进行了提取的研究。为了获得提取栀子黄色素最佳工艺条件,采用响应面法组合设计试验方法,建立了酶的用量、提取温度、提取时间之间关系。结果表明,最佳工艺条件为酶的用量4.33%,提取温度61.84℃,提取时间65.06 min,在此最佳提取条件下,栀子黄色素的吸光度为0.914。     

响应面法优化人工蛹虫草子实体中虫草酸微波提取工艺

为优化人工蛹虫草子实体中虫草酸的微波提取工艺,在单因素试验基础上,利用响应曲面法考察提取时间、微波功率和液固比对虫草酸提取率的影响,优化提取工艺.结果表明:人工培养蛹虫草子实体中虫草酸微波提取的优化工艺条件为:微波功率555 W,液固比35 mL/g,提取时间4min,提取2次,虫草酸提取率的理论值可达84.45％.     

响应面分析法优化超声提取蓖麻碱工艺

以蓖麻叶为原料,对蓖麻碱的超声提取工艺优化进行研究,在单因素试验的基础上,选择超声时间、超声功率、料液比为自变量,以蓖麻碱提取率为影响值,采用响应面试验设计方法,研究各自变量及其交互作用对蓖麻碱提取率的影响。利用Design Expert8软件得到回归方程得模型并进行响应面分析,确定超声提取蓖麻碱的最佳工艺条件为料水比为1∶25 g/mL,超声时间为103.03 min,超声功率为621.05 W,此条件下蓖麻碱的提取率为2.63‰。