利用基于CRISPR-Cas9 的基因编辑技术对miR-29a在GT1-7 细胞中进 行基因敲除

目的:本文利用CRISPR-Cas9技术在GT1-7细胞中对miR-29a基因进行基因编辑,用于构建miR-29a基因敲除GT1-7细胞模型。方法:通过构建Cas9稳转的GT1-7细胞株并转染sgRNA质粒用于在靶向miR-29a基因区域引发突变。然后构建EGFP与sgRNA共表达质粒并转染Cas9稳转GT1-7细胞,利用流式细胞仪富集表达绿色荧光蛋白的阳性细胞和分选阳性单克隆细胞。最后利用实时荧光定量PCR(realtimefluorescencequantitativePCR)对富集细胞和单克隆细胞进行miR-29a表达量检测。结果:T7E1检测结果显示CRISPR-Cas9系统有效地在miR-29a基因区域引发了突变。荧光定量PCR结果显示,与对照组相比,富集后阳性细胞miR-29a的表达量整体下降了50%左右(P0.05)。此外,通过流式筛选获得了一个纯合miR-29a基因敲除细胞克隆,与对照组相比,其miR-29a的表达量下降了75%左右(P0.05)。结论:本文建立了一种有效编辑GT1-7细胞基因的方法,并采用该方法构建了miR-29a稳定敲除细胞模型。     

链球菌病类活疫苗活菌计数参考品的研制

研制链球菌病类活疫苗活菌计数参考品,可以更加科学地评价活菌计数结果的准确性和有效性。首先,制备了一批链球菌病类活疫苗活菌计数参考品,对其物理性状、纯粹性、真空度、剩余水分进行检验,并对其均一性、运输稳定性、热稳定性进行测定,另组织3家单位通过协作标定的方式对参考品活菌数进行赋值,用协作标定法统计参考品在12个月内的保存期。参考品的性状检查、纯粹检验、真空度测定和剩余水分测定结果均符合《中国兽药典》的规定;均一性试验结果显示,参考品计数结果的变异系数小于10%,均一性良好;运输稳定性试验证明,参考品在夏季和冬季用泡沫盒加冰袋的方式运输3日内数值仍能保持稳定;加速热稳定性试验验证,参考品在–20 ℃条件下保存3个月、4 ℃条件下保存21 d内均可活菌数稳定;通过协作标定,统计出参考品活菌数的赋值范围为 (8.5–12.1)×107 CFU/支;保存期试验结果证实,参考品在–70 ℃以下保存一年内活菌数可维持稳定状态。链球菌病类活疫苗活菌计数参考品,不仅可以为链球菌病类活疫苗的活菌计数实验提供参照物,而且可以用于评价马丁琼脂培养基的质量,为兽用生物制品质量控制提供保障。     

miR-92a-3p和miR-25-3p海绵上调Kiss1并影响雌性小鼠的青春期启动及动情周期

下丘脑Kiss1神经元产生的神经肽kisspeptin通过影响促性腺激素释放激素的分泌,参与青春期的启动、生殖系统的成熟以及排卵等过程的神经内分泌调节。Kiss1基因的表达受到包括多种反式调控因子及表观遗传的调控。预测与前期研究表明,miR-92a-3p、miR-25-3p的种子序列能够与Kiss1的3′-UTR直接结合,抑制Kiss1的表达。为进一步研究miR-92a-3p、miR-25-3p在Kiss1表达调控中的作用,本研究分别构建了对miR-92a-3p、miR-25-3p具有抑制作用的特异性吸附海绵载体：sponge-miR-92a和sponge-miR-25,以实现miRNA的功能缺失。流式细胞术和双荧光素酶报告基因系统分别证实,这2个海绵载体均能够非常有效地吸附外源性或内源性靶miRNA。sponge-miR-92a和sponge-miR-25载体被进一步包装成慢病毒LV-sponge-miR-92a和LV-sponge-miR-25。实时荧光定量PCR结果显示,经LV-sponge-miR-92a和LV-sponge-miR-25感染的下丘脑原代神经元细胞中,Kiss1表达水平均显著上调（P<0.05）;将LV-sponge-miR-92a注射到下丘脑后,雌性小鼠阴门开启时间明显提前（P<0.05）;下丘脑注射LV-sponge-miR-92a和LV-sponge-miR-25扰乱了雌性小鼠的正常动情周期。综上所述,成功构建了能够有效吸附miR-92a-3p、miR-25-3p的海绵载体,证明它们在解除miR-92a-3p、miR-25-3p对Kiss1的抑制中的作用,下丘脑注射海绵对雌性小鼠的阴门开启时间和动情周期均产生一定程度的影响,提示miR-92a-3p、miR-25-3p可能在青春期的启动和生殖成熟过程中发挥重要的作用。     

紫杉醇构效关系研究进展

紫杉醇是近40年从红豆杉属植物中发现的最著名的天然抗肿瘤药物,在过去30年多年间紫杉醇因其独特的结构、新颖的作用机制和显著的抗癌活性成为化学家、药理学家和生物学家的研究热点.本文对紫杉醇构效关系的研究进行了总结,提供参考文献85篇.     

辣椒素的提取及抑菌活性研究

以干红辣椒为原料,选取95%的乙醇和正己烷作为提取溶剂,利用索氏提取法提取其中的辣椒素。结果表明,以95%的乙醇作为提取溶剂的效果好于正己烷,辣椒素的提取率最高可达1.77%,高于正己烷的1.12%的提取率。用滤纸片法研究辣椒素对大肠杆菌等8种常见食品腐败菌的抑菌活性。结果表明:辣椒素对金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌有明显的抑菌效果,对大肠杆菌抑菌作用较弱,对黑曲霉、青霉、保加利亚乳酸杆菌和噬热链球菌没有作用。辣椒素经过高温灭菌后,抑菌作减弱,培养时间对抑菌圈的影响不大。以正己烷为助溶剂,确定辣椒素对枯草芽孢杆菌的最低抑菌浓度(MIC)为50mg/mL。     

单增李斯特菌感染致妊娠失败的研究进展

单增李斯特菌(Listeria monocytogenes, LM)是一种在自然界广泛存在的食源性人兽共患病原菌,妊娠动物和孕妇感染后会导致妊娠失败。研究显示,LM感染后随着血液循环到达胎盘,在其毒力因子(内化素A、李斯特菌溶血素O、肌动蛋白聚合蛋白、InlP蛋白等)的作用下,首先靶定绒毛膜外滋养层细胞,再穿过合体滋养层细胞或绒毛细胞滋养层细胞到绒毛基质,再通过胎儿毛细血管感染胎儿;在此过程中,LM诱导的胎盘细胞凋亡、母胎界面细胞因子表达水平的改变和胎盘细胞炎性体的激活导致了妊娠失败。该文对上述问题就国内外最新研究进展进行综述和探讨。     

丁香挥发油化学成分与抗菌活性研究

利用气相色谱—质谱(GCMS)法结合化学计量学方法对丁香挥发油化学成分进行了分析研究。得益于化学计量学分辨方法,从丁香花蕾与丁香果实中共鉴定了46种化合物。其中从丁香果实挥发油中鉴定了41种化合物,占挥发油总量的94.154%;从丁香花蕾挥发油中鉴定出30种化合物,占其挥发油总量的98.418%。2,3,4trimethoxyacetophenone和2methoxy4[2propenyl]phenolacetate为首次从丁香挥发油中鉴定得到。两种已经确认具有生物活性的化合物丁子香酚和石竹烯在丁香果挥发油分别为22.667%和7.147%,而在丁香花蕾挥发油中含量分别为和57.133%和14.408%,二者在相对含量上差异较大。体外抗菌试验结果表明,这两种挥发油对金黄色葡萄球菌和白色念珠菌十分敏感,对大肠杆菌和枯草杆菌敏感。而丁香花蕾挥发油对所有试验菌株都比丁香果挥发油表现出更强的抗菌活性,我们认为这可能是前者丁子香酚和石竹烯含量高的原因。     

成簇pri-miRNAs表达载体的构建及表达验证

目的:旨在建立一个多重表达任意miRNA的方案,实现多个pri-miRNA表达阅读框的串联,用于miRNA簇或者miRNA家族的功能研究。方法:通过改造CRISPR/Cas9系统共表达载体42230,插入EGFP编码序列以及单个pri-miRNA序列,实现单个pri-miRNA表达载体可视化的构建。在单个pri-miRNA表达载体的基础上,通过同源重组的方式,插入下一个pri-miRNA序列,实现多个pri-miRNA表达阅读框的串联表达。结果:以miR29家族的三个miRNA为例,验证了在pri-miRNA表达阅读框串联方面的可行性;在多重的pri-miRNA表达载体中,miRNA成熟体验证结果表明,pri-miR29a和pri-miR29b能够在哺乳动物细胞中被加工成熟,其成熟体明显地过表达。在转染的293A细胞中,miR29家族的靶基因PTEN的表达水平显著降低。结论:所构建的pri-miRNA多重表达方案,能够实现多个外源miRNA在同一细胞中的共表达,对于探索miRNA家族和miRNA簇的拮抗或协同调控功能起到重要的推进作用。     

骨调节蛋白作为潜在的胃癌预后标志物及免疫治疗新靶点

胃癌患者术前检测能够预测其术后生存的标志物对外科术式和术后放化疗及随访有重要提示意义.本文利用多中心癌症公共数据库及在线分析,经过qRT-PCR及Western印迹等检测进行验证,发现骨调节蛋白(osteomodulin,OMD)在胃癌组织中高表达(P=0.015),能够影响胃癌患者生存预后(P＜0.001),且可在术...