无机钼酸在棕色固氮菌(Azotobacter vinelandii)体内的累积和转化

醋酸铵培养的棕色固氮菌(Azotobacter vinelandii),经超声击碎高速离心制备粗提取液、DEAE-纤维素柱层析表明,体内~(99)MoFe蛋白合成受到阻遏,在0.15 M NaGl洗脱分部中,除~(99)Mo储存蛋白峰外,还存在一个无机~(99)MoO_4~=组分。醋酸铵培养的棕色固氮菌经去阻遏后,在体内固氮活性出现的同时,可观察到原先菌体内累积的~(99)Mo储存蛋白峰降低,无机~(99)MoO_4~=的组分几乎消失以及~(99)MoFe蛋白合成。若去阻遏过程存在氯霉素,则菌体不显示固氮活性,(99)MoFe蛋白不再合成,储存蛋白和无机铝酸组分中~(99)Mo的转移停止。     

简易的无氧柱层析方法

柱层析(离子交换,吸附和凝胶过滤)是分离纯化蛋白质,酶和其他一些生物活性物质的重要手段。国外已有各种型号的成套装置作为商品出售,但是遇到对氧敏感的样品,必须设法在整个操作过程中,保持无氧状态。几年来我们在固氮酶的研究中,逐步掌握了一些简单而行之有效,且在一般实验室条件下都能办到的无氧柱层析方法。现在扼要介绍如下,以供有关工作参考。一、应用器皿中气体的抽换首先要把实验中所用的贮液瓶及收集瓶中的空气都换成惰性气体(如氮、氩等)。根据需要可选用不同容积的抽滤瓶盛装洗脱液。抽滤瓶口的橡皮塞中插入一玻璃管,管口配以尺寸合适的盐水瓶塞,如图1所示。     

ATP,Fe-S原子簇在固氮酶催化反应中的作用——模型研究

由无机钼盐与某些巯基化合物或巯基蛋白组成的固氮酶模型系统,以NaBH_4作还原剂,催化还原固氮酶的底物乙炔为乙烯。催化活性受ATP显著的促进。ATP的作用不能完全用质子酸来解释,因为催化活性的促进受ATP浓度、不同种类缓冲液和不同离子强度的影响。 在所有Mo-SH催化剂中,Mo-Fd催化活性最高。并且,在PH≌9.0左右的条件下,与固氮酶相仿,也能利用Na_2S_2O_4为还原剂,催化还原乙炔。当除去天然Fd的Fe-S辅基以后,剩下的蛋白部分再与无机钼盐配位络合,催化活性下降,而且不再能利用Na_2S_2O_4为还原剂。因此,Fd的特殊作用与它分子中含Fe-S原子簇相关。     

烟草核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶/加氧酶四级结构的研究(英文)

本文提出三种证据证明烟草核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶/加氧酶(Rubisco)的大亚基伸展在小亚基的外面,小亚基排列在大亚基中间的概念。证据是:1.固定化胰蛋白酶在一定条件下可水解RubisCO的大亚基但不水解小亚基,而天然胰蛋白酶水解大亚基,也水解小亚基。2.固定化抗小亚基IgG-Sepharose可与游离的小亚基相结合,但不能与全酶结合。3.低浓度尿素处理可使固定化的RubisCO-Sepharose上的小亚基解离下来,而大亚基仍结合在载体上,这说明RubisCO是通过定位在分子表面上的大亚基的ε-氨基与Sepharose共价偶联的。当RubisCO中的小亚基全部被解离后,大亚基之间的结合进一步增强,这时解离大亚基所需的尿素浓度要比小亚基存在时高。任何RubisCO的四级结构模型都应将小亚基置于大亚基中间受保护的位置,一部份小亚基可暴露于全酶分子表面。     

钨酸盐去阻遏的棕色固氮菌提取液中无机钼酸对固氮酶的活化

钨酸盐中培养并去阻遏的棕色固氮菌(W-Av)只有极微弱的固氮酶活性(0.3～0.5 nmole C_2H_4/分/毫克W-Av蛋白)。当以部分纯化的钼铁蛋白补入W-Av的提取液中,后者的固氮酶活性能够上百倍地提高。当有适量保险粉及ATP和ATP发生系统存在时,W-Av提取液与钼酸钠在30℃下保温,固氮酶得到活化。在本实验的最适条件下,固氮酶的活性可达5～8nmole C_2H_4/分/毫克W-Av蛋白或25～40n mole C_2H_4/分/n mole Mo。就固氮酶的活化来说,W-Av提取液是比较稳定的,在-15℃下冻存可维持二十天以上,60℃加热5分钟,总活性约降低一半。W-Av提取液与钼酸钠保温后在-15℃下保存四天,已活化的固氮酶活性也只比对照略为降低。钨酸盐抑制固氮酶的活化,但不抑制已活化的固氮酶活性。     

光合细菌(Rhodopseudomonas capsulata)固氮活性与钼的吸收

利用紫色非硫细菌能在厌气光照下和好气黑暗下交替生长的特点和同位素~(99)Mo示踪,来探讨Rhodopseudomonas capsulata中Mo的积累与固氮酶合成的关系。 用硫酸铵和谷氨酸盐作为氮源,把Rps. capsulata置于厌气光照下生长。由于硫酸铵阻遏固氮酶,所以菌体内既无固氮酶活性也无~(99)Mo积累。而谷氨酸盐解遏固氮酶的合成,菌体则显示固氮活性并有~(99)Mo积累。 黑暗好气生长的Rps. capsulata菌体既无固氮活性,也没有~(99)Mo的积累。将这样的菌体转移到含~(99)Mo(无谷氨酸)的培养液进行光照,固氮酶活性迅速出现,同时有~(99)Mo的积累。在Rps. capsulata中钼的吸收与固氮酶的合成及活性是紧密偶联的。     

改良的微量氨扩散法

在生物固氮过程中已证实氨是直接产物。完整的有机体可将固定的氮迅速地转变成氨基酸并进而合成蛋白质,而固氮有机体的提取物和纯化的固氮酶制备物能定量地生成氨。这种氨的增加可作固氮指标。氨的定量测定方法有好多种,我们选择了微量扩散法结合比色法,并将容器进行适当改进,建立了比较简易的微量氨测定法。     

一种高比活性菠菜RuBP羧化酶的纯化方法

以前,我们曾报道过一种纯化菠菜RuBP羧化酶的方法。但用该法提纯的酶的比活性较低。为此,我们又采用一种免除     

一种测定固氮酶含钼组分中~(99)Mo的γ射线计数器

利用同位素标记,示踪原子在生物体内的代谢行径是一种既简便又准确的技术方法,这种技术方法能广泛地应用于医学、生物学,特别是生理生化有关机制方面的研究。放射性同位素能自发地放射出诸如α、β、γ粒子,这些射线对人体均有伤害,其中γ射线穿透力最强。因此在示踪技术中,计数放射γ粒子的脉冲时,对于仪器的自动测量、灵敏度、快速、简便等性能就显得特别重要。我们使用的西安262厂生产的γ免疫计数器是较为理想的一种仪器。虽然这种仪器原为医疗卫生系统的放射免疫测定所设计,但对于γ射线能量在20keV至500kV范围内标记的同位素均可应用。它具有较高探测效率和较低本底计数的γ射线探测性能,自动换样,自动扣除本底而计数,并通过打印机给出结果。     

在有无结合态氮的培养条件下棕色固氮菌对钼的吸收和转化

在尿素中培养的棕色固氮菌,从培养液中吸收。~(99)MoO_4~-的量与N_2下培养的菌基本上是相同的。凝胶过滤实验指出,有尿素时掺入菌体内的~(99)Mo也主要与蛋白质结合,而不是以无机(99)MoO_4~-的状态存在。在尿素和N_2下生长的棕色固氮菌体内的。~(99)Mo-蛋白质可以用DEAE-纤维素柱层析区别开来。