嗜热四膜虫可变剪接基因鉴定及功能分析

可变剪接是产生蛋白质组多样性和调节基因表达的重要机制,相关研究在高等真核生物中开展较多,而在单细胞真核生物中则较少,尤其是单细胞原生动物纤毛虫中,仅有少量报道。本文基于单细胞模式原生动物嗜热四膜虫种大量转录组数据,对其可变剪接基因进行了鉴定及分析。在嗜热四膜虫中共鉴定到2 894个可变剪接位点,涉及到2 698个可变剪接基因,可分为四类。考虑到转录本拼接的准确性,选择了其中464个与基因组预测模型完全一致的可变剪接基因进行深入分析,其中生长(growth)时期、饥饿(starvation)时期、接合生殖(conjugation)时期特异性的可变剪接基因分别为49个、79个和135个。对可变剪接基因的功能进行分析表明其涉及的功能广泛且显著富集于蛋白激酶过程,提示可变剪接基因在嗜热四膜虫蛋白磷酸化和信号传导中具有重要作用。     

四膜虫基因表达数据库: 四膜虫全基因组基因表达芯片和协同表达分析的数据资源

嗜热四膜虫是一种优良的真核模式生物, 对其功能基因组学的分析将为研究细胞和分子生物学的基础性重大问题提供新的机遇. 四膜虫基因表达数据库(TGED)是原生动物纤毛虫中第一个基因表达数据库, 整个数据库包括了四膜虫3个重要的生理和发育阶段20个时间点的全基因组基因表达数据, 提供了友好的网页界面(http://tged.ihb.ac.cn)供用户获取这些数据. 通过基因的标识号或描述信息, 用户可以获取基因表达谱信息和协同表达基因. 此外, TGED同时提供了制备四膜虫基因表达芯片的样品制备方法. 欢迎研究者上传和分享其所有的基因芯片数据, 以期为四膜虫或纤毛虫研究提供重要的功能基因组学资源.     

四膜虫rDNA表达载体的改造及用于异源基因的高效表达

基于四膜虫小核rDNA改造得到的pD5H8载体,在转染进接合生殖时期的四膜虫后能发育成9000~10000拷贝的大核rDNA,因此pD5H8载体是四膜虫异源基因表达的研究热点;但其载体上匮乏合适的克隆位点和无启动子结构阻碍了该载体的进一步发展。本研究在四膜虫启动子HSP70-2和终止子HSP70-1之间,通过稀有酶切位点I-Sc e玉导入细菌绿色荧光蛋白(HGFP)这一筛选标记,由此组成的DNA片段(HSP70-25' UTR-I-Sce玉-HGFP-I-Sce玉-HSP70-13' UTR)整合进pD5H8,将之改造成pD5H8-HGFP表达载体。来自真核生物的绿色荧光蛋白(GFP)藉由I-Sc e玉酶切位点一步导入pD5H8-HGFP表达载体后,在四膜虫中大量表达且具有生物学活性。因此,改造后的pD5H8-HGFP表达载体拥有一步法引入异源基因,几乎无酶切位点的限制,有效的筛选标记,高效的异源基因表达能力,以及环境友好、便捷可控等诸多优点,这对于深入开展四膜虫基因功能的过表达研究和开发异源基因在四膜虫这一真核表达系统中的应用奠定了技术基础。     

三种四膜虫全基因组N6-甲基腺嘌呤比较研究

为了揭示N6-甲基腺嘌呤(6mA)在近缘物种间的分布规律和物种进化过程中的变化, 研究在分离2种四膜虫(Tetrahymena malaccensis和Tetrahymena pyriformi)大核的基础上, 利用三代测序技术绘制了其全基因组单碱基分辨率6mA图谱, 结合公共数据库中已有的模式种Tetrahymena thermophila数据, 开展了3种四膜虫比较6mA甲基化组分析, 发现: (1)3种四膜虫6mA甲基化位点分布特征类似, 包括呈约200 bp周期性分布和具有保守AT基序; (2)6mA主要分布于基因的5′端, 在种间直系同源基因上的分布模式具有区域近似性, 但在单碱基水平不完全保守; (3)在种内近期复制的并系同源基因中, 6mA分布在单碱基水平具有较高的保守性; (4)结合3种四膜虫的分化时间, 估算出了四膜虫中6mA动态变化过程, 6mA位点建立的速度大约为每Mb每百万年69.9—226个位点。     

ABC转运蛋白提升四膜虫对DDT的耐受能力

世界卫生组织允许DDT在部分国家和地区使用.大规模频繁使用杀虫剂造成了蚊子的抗药性,大大降低了DDT的防治效果.目前对于DDT的耐受主要集中在蚊子,但对于喷洒的DDT进入水生态系统后,造成食物链底层水生生物体对DDT耐受还未见报道.本研究对DDT胁迫下的四膜虫全基因组中筛选出一个ATP结合盒转运蛋白基因(abcb15),它能够识别DDT作为其转运的底物.绿色荧光蛋白标记显示ABCB15蛋白定位于细胞膜上,是一个细胞膜泵蛋白.基因敲降技术造成的abcb15基因敲降株在DDT胁迫下表现出更低的生长速率,这表明ABCB15膜泵蛋白能够将进入细胞内的DDT转运至细胞膜外,藉以提高四膜虫对DDT的耐受能力,以减轻DDT对细胞的损伤.     

嗜热四膜虫腺苷三磷酸结合盒转运蛋白ABCC10基因的可变剪切分析

哺乳动物中腺苷三磷酸结合盒转运蛋白(ATP-binding cassette transporter,ABCT)可通过可变剪切产生多种转录本,其中含有提前终止密码子(premature terminal codon,PTC)的转录本还可与无义介导的mRNA降解通路(nonsense-mediated mRNA decay,NMD)作用来调节蛋白的相关功能,但这些现象尚未在低等生物的ABCT研究中发现.该文以单细胞原生动物——嗜热四膜虫为对象,利用转录组数据发现ABCC10基因存在可变剪切,并产生两条转录本(SV1和SV2),其中SV2在第五个内含子处发生内含子保留事件,这段长49bp的序列使SV2发生移码并产生PTC.在构建NMD通路中关键因子UPF1基因的嗜热四膜虫敲降株的基础上,利用实时荧光定量PCR方法检测SV2的转录情况.结果显示:含有PTC的转录本SV2在UPF1敲降株中的转录水平相对于野生型显著增加,说明SV2可被NMD通路降解.这与高等动物中某些ABCC蛋白通过可变剪切引入含PTC转录本,并能被NMD降解的方式一致,推测该方式在真核生物中十分保守,并在真核生物的共同祖先(the last eukaryotic common ancestor)中就已形成.