嗜热四膜虫可变剪接基因鉴定及功能分析

可变剪接是产生蛋白质组多样性和调节基因表达的重要机制,相关研究在高等真核生物中开展较多,而在单细胞真核生物中则较少,尤其是单细胞原生动物纤毛虫中,仅有少量报道。本文基于单细胞模式原生动物嗜热四膜虫种大量转录组数据,对其可变剪接基因进行了鉴定及分析。在嗜热四膜虫中共鉴定到2 894个可变剪接位点,涉及到2 698个可变剪接基因,可分为四类。考虑到转录本拼接的准确性,选择了其中464个与基因组预测模型完全一致的可变剪接基因进行深入分析,其中生长(growth)时期、饥饿(starvation)时期、接合生殖(conjugation)时期特异性的可变剪接基因分别为49个、79个和135个。对可变剪接基因的功能进行分析表明其涉及的功能广泛且显著富集于蛋白激酶过程,提示可变剪接基因在嗜热四膜虫蛋白磷酸化和信号传导中具有重要作用。     

有机污染物二氯二苯三氯乙烷、三丁基锡和2，3，7，8-四氯二苯并二嗯英暴露下的四膜虫毒理基因组学研究

有机污染物二氯二苯三氯乙烷（DDT）、三丁基锡（TBT）和2,3,7,8．四氯二苯并二嗯英（TCDD）因对水生生态系统的危害以及对人体健康造成的严重伤害而受到重视．本实验以模式生物原生动物嗜热四膜虫为研究对象,利用microarray技术筛选了在上述3种污染物下分别暴露24h后差异表达2倍以上的基因,并在geneontology功能注释的基础上,通过富集分析考察了这些基因涉及的主要功能,其中许多功能和多细胞生物中的报道相一致．随后,以TCDD中富集功能注释的基因为核心,通过CLR算法构建了TCDD相关基因的相互作用网络,依照功能将其划分为2个亚网络,并在此基础上推测了TCDD在四膜虫中的作用机制模型．结果显示,四膜虫具有成为在基因组水平研究毒物作用机制的单细胞生物模型的巨大潜力．     

6种累枝虫(Epistylis)rRNA基因18S-ITS1序列及其分子系统发育关系

建立了由采自自然界中的样品、不经实验室培养而直接用于大核DNA提取和PCR反应的原位(in situ)方法; 在此基础上, 测定并比较了6种累枝虫(Epistylis wenrichi, E. urceolata, E. chrysemydis, E. plicatilis, E. hentscheli, E. galea)的18S-ITS1序列, 结果显示: E. wenrichi, E. urceolata, E. chrysemydis, E. plicatilis和E. hentscheli间18S和ITS1区序列的碱基相似性很高, 而它们与E. galea间碱基变异位点在18S区和ITS1区均高达33个以上, 遗传变异度分别大于15%和23%. 以多态喇叭虫(Stentor polymorphus)为外类群, 利用最大简约法、最大似然法和邻接法构建了它们的系统发育树.分析指出: E. galea和其他5种累枝虫分属为两个类群, 与其他5种累枝虫相比, E. galea可能较早从祖先种中分化出来; 相比其他特征, 大核和口围区可能与累枝虫进化的关系更为密切, 是重要的系统发育特征.     

纤毛虫分子系统发育学的研究进展

在回顾纤毛虫分子系统发育学产生发展历史的基础上,介绍了随着20年中RFLP、RAPD和DNA序列分析等分子生物学技术作为该学科的主要研究方法在种群遗传多样性与进化、种上阶元系统发育学两方面取得的研究成果和近期研究进展,最后在探讨纤毛虫分子系统发育学存在的一些问题和解决方法的同时,预测了纤毛虫分子系统发育学今后将极大地推动真核生物的起源与进化,内共生等重要生物进化问题的研究。     

Phylogenetic relationships among six species of Epistylis inferred from 18S-ITS1 sequences

Phylogenetic relationships among six species of Epistylis (i. e. E. plicatilis, E. urceolata, E. chrysemydis, E. hentscheli, E. wenrichi, and E. galea) were investigated using sequences of the first internal transcribed spacer region (ITS-1) of ribosomal DNA (rDNA). Amplified rDNA fragment sequences consisted of 215 or 217 bases of the flanking 18S and 5.8S regions, and the entire ITS-1 region (from 145 to 155 bases). There were more than 33 variable bases between E. galea and the other five species in both the 18S region and the ITS-1 region. The affiliation of them was assessed using Neighbor-joining (NJ), maximum parsimony (MP) and maximum likelihood (ML) analyses. In all the NJ, MP and ML analyses E. galea, whose macronucleic position and shape are distinctly different from those of the other five species, was probably diverged from the ancestor of Epistylis earlier than the other five species. The topology in which E. plicatilis and E. hentscheli formed a strongly supported sister clade to E. urceolata, E. chrysemydis, and E. wenrichi was consistent with variations in the thickness of the peristomial lip. We concluded that the macronucleus and peristomial lip might be the important phylogenetic characteristics within the genus Epistylis.     

海洋喇叭虫rRNA基因18S-ITS1序列及其系统发育分析

海洋喇叭虫Maristentor dinoferus 1996年在关岛(Guam)的珊瑚暗礁上被发现,至今尚未阐明其确切的系统发育地位.克隆到的海洋喇叭虫的18S-ITS1-5.8S rDNA序列包括222 bp的18S序列,77 bp的ITS1序列和22 bp的5.8S序列.比较分析了纤毛虫主要类群的ITS1序列后得出:短的ITS1序列可能是异毛类纤毛虫的特征.根据18S序列,利用邻接法构建,最大简约法和最大似然法构建系统发育树.其拓扑结构显示海洋喇叭虫属于异毛纲纤毛虫,但并不隶属喇叭虫科,应予以新的分类地位.     

两种缘毛类纤毛虫胞质Hsp70基因序列的克隆及其系统发育分析

克隆得到2种缘毛类纤毛虫——钟形钟虫(Vorticella campanula)和螅状独缩虫(Carchesium polypinum)的胞质Hsp70基因部分序列,长度均为438bp,编码146个氨基酸。以细菌为外类群,利用最大似然法和邻接法构建包括其他5种纤毛虫在内的共26个物种的Hsp70基因氨基酸序列系统发育树,其拓扑结构显示：V．campanula和C．polypinum聚在一起,并与另2种寡膜纲的嗜热四膜虫(Tetrahymena thermophila)及草履虫(Paramecium tetraurelia)聚为姊妹枝,提示了缘毛类纤毛虫为单系,且隶属于寡膜纲的系统发育地位。     

四膜虫基因表达数据库: 四膜虫全基因组基因表达芯片和协同表达分析的数据资源

嗜热四膜虫是一种优良的真核模式生物, 对其功能基因组学的分析将为研究细胞和分子生物学的基础性重大问题提供新的机遇. 四膜虫基因表达数据库(TGED)是原生动物纤毛虫中第一个基因表达数据库, 整个数据库包括了四膜虫3个重要的生理和发育阶段20个时间点的全基因组基因表达数据, 提供了友好的网页界面(http://tged.ihb.ac.cn)供用户获取这些数据. 通过基因的标识号或描述信息, 用户可以获取基因表达谱信息和协同表达基因. 此外, TGED同时提供了制备四膜虫基因表达芯片的样品制备方法. 欢迎研究者上传和分享其所有的基因芯片数据, 以期为四膜虫或纤毛虫研究提供重要的功能基因组学资源.     

镉和铜对嗜热四膜虫金属硫蛋白基因的诱导表达

本文在荧光定量PCR优化的基础上,利用该技术考察了不同浓度的重金属镉和铜对嗜热四膜虫金属硫蛋白基因(MTT1)诱导表达的变化规律。结果表明MTT1基因的表达对镉离子的诱导更灵敏,且在一定阈值浓度(≤35.2μmol/L)范围内,镉离子浓度升高会增加MTT1基因表达量,超过该阈值后表达量迅速下降;镉与铜同时诱导时MTT1基因的表达情况与镉单独诱导的类似,但阈值浓度减小为22μmol/L,表明二者的联合毒性为协同作用。镉离子浓度低于22μmol/L时,与铜离子的共同作用会大大增加MTT1基因的表达量,从而增强了四膜虫的解毒能力。     

四膜虫rDNA表达载体的改造及用于异源基因的高效表达

基于四膜虫小核rDNA改造得到的pD5H8载体,在转染进接合生殖时期的四膜虫后能发育成9000~10000拷贝的大核rDNA,因此pD5H8载体是四膜虫异源基因表达的研究热点;但其载体上匮乏合适的克隆位点和无启动子结构阻碍了该载体的进一步发展。本研究在四膜虫启动子HSP70-2和终止子HSP70-1之间,通过稀有酶切位点I-Sc e玉导入细菌绿色荧光蛋白(HGFP)这一筛选标记,由此组成的DNA片段(HSP70-25' UTR-I-Sce玉-HGFP-I-Sce玉-HSP70-13' UTR)整合进pD5H8,将之改造成pD5H8-HGFP表达载体。来自真核生物的绿色荧光蛋白(GFP)藉由I-Sc e玉酶切位点一步导入pD5H8-HGFP表达载体后,在四膜虫中大量表达且具有生物学活性。因此,改造后的pD5H8-HGFP表达载体拥有一步法引入异源基因,几乎无酶切位点的限制,有效的筛选标记,高效的异源基因表达能力,以及环境友好、便捷可控等诸多优点,这对于深入开展四膜虫基因功能的过表达研究和开发异源基因在四膜虫这一真核表达系统中的应用奠定了技术基础。