嗜热四膜虫腺苷三磷酸结合盒转运蛋白ABCC10基因的可变剪切分析

哺乳动物中腺苷三磷酸结合盒转运蛋白(ATP-binding cassette transporter,ABCT)可通过可变剪切产生多种转录本,其中含有提前终止密码子(premature terminal codon,PTC)的转录本还可与无义介导的mRNA降解通路(nonsense-mediated mRNA decay,NMD)作用来调节蛋白的相关功能,但这些现象尚未在低等生物的ABCT研究中发现.该文以单细胞原生动物——嗜热四膜虫为对象,利用转录组数据发现ABCC10基因存在可变剪切,并产生两条转录本(SV1和SV2),其中SV2在第五个内含子处发生内含子保留事件,这段长49bp的序列使SV2发生移码并产生PTC.在构建NMD通路中关键因子UPF1基因的嗜热四膜虫敲降株的基础上,利用实时荧光定量PCR方法检测SV2的转录情况.结果显示:含有PTC的转录本SV2在UPF1敲降株中的转录水平相对于野生型显著增加,说明SV2可被NMD通路降解.这与高等动物中某些ABCC蛋白通过可变剪切引入含PTC转录本,并能被NMD降解的方式一致,推测该方式在真核生物中十分保守,并在真核生物的共同祖先(the last eukaryotic common ancestor)中就已形成.     

嗜热四膜虫减数分裂研究进展

减数分裂是真核生物有性生殖过程的关键步骤,染色体的行为变化贯穿整个减数分裂的过程。近些年来,借助先进的分子生物学技术和细胞学实验手段,通过对突变细胞株的筛选和评价,单细胞真核模式生物原生动物嗜热四膜虫(Tetrahymena thermophila)减数分裂方面的研究取得了长足的进展。本文主要介绍嗜热四膜虫减数分裂的过程,以及在此过程中伴随染色体行为变化的相关基因的功能,从而为进一步探讨嗜热四膜虫减数分裂的分子机制提供有效信息。     

四膜虫功能基因组数据库增量更新2016:生活史和减数分裂转录组及磷酸化蛋白组资源建设

原生动物嗜热四膜虫是一种优良单细胞真核模式生物,以其作为研究对象在基础生物学领域的研究已经取得了一系列突破性的成果。2006年,其大核基因组测序完成并发表,标志着四膜虫的研究进入了功能基因组时代。2013年基于基因芯片、基因网络和转录组数据,我们构建了四膜虫功能基因组数据库,其目前已成为模式生物嗜热四膜虫研究的两个重要数据库之一。在过去几年里,随着对四膜虫功能基因组学研究的深入,相关组学数据也实现了一定积累,对这些数据的整合也非常迫切。基于此,我们对四膜虫功能基因组数据库进行了增量更新。更新内容主要包括三个方面:(1)四膜虫生活史不同时期转录组数据;(2)四膜虫接合生殖减数分裂过程转录组数据;(3)磷酸化蛋白组数据。此次增量更新进一步提升和完善了四膜虫功能基因组数据库的内容和功能,对以四膜虫为对象的相关研究工作具有重要作用。     

可动性I型内含子

真核生物绝大多数基因初始转录物的后加工过程涉及内含子(intron,亦称间插序列IVS)的切除和外显子(exon)的连接。自从Kruger和Cech等人首次发现嗜热四膜虫(Tetrahymena thermophila)大亚基rRNA的间插序列能够催化自身切除和外显子连接以来,自我剪接内含子(self splicing intron)及其他有催化功能的RNA的例子在不断增多.RNA催化功能的发现强     

基于RNA-seq测序数据鉴定和分析猪基因组可变剪接事件

可变剪接作为一种增加基因组和蛋白质组多样性的重要机制,广泛发生于真核生物基因转录的过程中.本文采用Illumina Hiseq 2500测序平台对猪睾丸组织4个不同发育时期(60胚龄、90胚龄、30日龄和180日龄)进行转录组测序,以猪基因组数据为参考,鉴定和分析了猪基因组可变剪接事件.从猪基因组中鉴定出20398个基因(80.6%)对应的92738个可变剪接事件.在不同的可变剪接类型中,以第一个外显子可变剪切(alternative 5′first exon,TSS)、最后一个外显子可变剪切(alternative 3′last exon,TTS)、单外显子跳跃(skipped exon,SKIP)和可变5′或3′端剪切(alternative exon ends,AE)4种类型为主,分别占所有可变剪接事件的41.0%,32.9%,7.6%和7.4%.GO功能富集分析显示,发生可变剪接的基因主要富集于物质合成、物质结合及酶活性相关的GO项中,而各发育时期特异的可变剪接基因与发育时期的生理状态密切相关,60胚龄时主要与酶活性和组织形成相关,30日龄时主要与抗环境应激和离子通道活性相关,180日龄时则主要与循环系统相关.此外,在筛选出64个与睾丸素代谢相关的基因中,63个基因发生可变剪接,且以TSS和TTS为主,表明这两种可变剪接类型与睾丸素合成和分泌密切相关.通过对猪基因组可变剪接的分析,为深入研究可变剪接生物学功能及进一步开展分子育种工作提供理论依据.     

嗜热四膜虫——具有发展潜力的功能基因组学研究模型

在真核生物的分子生物学和遗传学研究方面,纤毛类原生动物嗜热四膜虫(Tetrahymenathermophila)已经被证明是一种有价值的生物学模型。通过对它的研究,人们发现并且掌握了核酶的分子机制、RNA的自我拼接、端粒的结构和功能、DNA序列重组等机理。这种原生动物的基因组功能分别由两个细胞核执行,即二倍体的小核与生殖过程有关,而多倍体的大核决定细胞的基因转录,并为转化基因的表达提供了强有力的手段。     

绵羊不同发育阶段背最长肌组织中可变剪接的鉴定与分析

可变剪接(Alternative splicing,AS)是动植物体内蛋白质多样性和遗传多样性的重要调控机制。为鉴定和分析绵羊不同发育阶段背最长肌组织中可变剪接,对多浪绵羊妊娠90日龄胎儿(F90)、出生后30日龄羔羊(L30)和成年3岁羊(A3Y)的背最长肌组织进行转录组测序,利用rMATS软件鉴定样品中的可变剪接事件和差异剪接基因(Differential splicing gene,DSG),并对DSG进行GO和KEGG功能富集分析。结果表明,绵羊背最长肌组织在F90、L30和A3Y时期分别鉴定出13 923、11 959和12 164个可变剪接事件,其中外显子跳跃(Skipped exons,SE)的比例最高,约为70.69%,5'端可变剪接位点(Alternative 5'splice sites,A5SS)、3'端可变剪接位点(Alternative 3'splice sites,A3SS)、互斥外显子(Mutually exclusive exons,MXE)和内含子保留(Retained introns,RI)的比例分别约为7.28%、11.18%、5.96%和4.84%。在F90_vs_L30、F90_vs_A3Y和L30_vs_A3Y比较组中分别鉴定到2 545、2 689和1 701个显著的差异剪接基因(P0.05)。GO和KEGG功能富集分析显示,差异剪接基因显著富集到横纹肌发育、肌肉结构发育、肌细胞分化、肌膜、胰岛素信号通路、Wnt信号通路、MAPK信号通路等与肌肉发育密切相关的通路上。上述结果表明可变剪接在背最长肌发育中发挥重要作用。     

东方蜜蜂微孢子虫基因的可变剪接及可变腺苷酸化解析

本研究旨在基于已获得的第三代纳米孔全长转录组数据对东方蜜蜂微孢子虫Nosema ceranae基因的可变剪接（alternative splicing,AS）和可变多聚腺苷酸化（alternative polyadenylation,APA）进行分析。通过Astalavista软件鉴定东方蜜蜂微孢子虫基因的AS事件类型。采用TAPIS pipeline对东方蜜蜂微孢子虫基因的APA位点进行鉴定。利用MEME软件分析所有全长转录本的poly (A)剪接位点上游50bp的序列特征并鉴定motif。共鉴定出发生于5个基因的5次AS事件,包括1次可变供体位点（alternative donor site,ADS）和4次内含子保留（intron retention,IR）。鉴定出233个基因发生APA,其中含有1个poly (A)剪接位点的基因数量最多（143,61.37%）。序列特征分析结果显示,东方蜜蜂微孢子虫全长转录本的3’ UTR的上下游表现出明显的碱基倾向性,U在3’ UTR的上游富集,而A在3’ UTR的下游富集。此外,在东方蜜蜂微孢子虫全长转录本的poly (A)剪接位点上游鉴定到3个motif（AAUAAA、UGAUGC和GCGACG）。研究结果揭示了东方蜜蜂微孢子虫转录组的复杂性,完善了现有的参考基因组和转录组注释,也为深入探究不同剪接异构体的分子功能提供了基础。此外,本研究为其他真菌的AS和APA研究提供了有益的思路和方法借鉴。     

八肋游仆虫核糖体蛋白L11的基因克隆与序列分析

以单细胞真核生物八肋游仆虫Euplotes octocarinatus为实验材料,采用PCR、RT-PCR方法克隆了核糖体蛋白L11基因(EoRPL11).将该序列与GenBank中其他物种的RPL11基因序列进行同源性比对,采用DNAStar软件进行聚类分析.结果显示,成功克隆到游仆虫RPL11基因,大核中该基因全长709 bp,开放阅读框(ORF)为531 bp,编码176个氨基酸;cDNA序列与大核中ORF序列一致,表明该基因具有转录活性;所推导的氨基酸序列与嗜热四膜虫Tetrahymena thermophila的RPL11同源性最高,为66%.     

诱导嗜热四膜虫(Tetrahymena thermophila)细胞凋亡样变化的研究

本文以单细胞真核生物嗜热四膜虫(Te-trahymena thermophila)作为实验材料以抗肿瘤药物高三尖杉脂碱(Homoharringtonine,HHT)、糖皮质激素类药物地塞米松(9α-Fluo-ro-16α-methylprednisolone,Dex)和抗生素类药物放线菌素D(Actinomycin D)诱导嗜热四膜虫凋亡并研究其细胞凋亡过程的生物化学特性。结果表明抗肿瘤药物及抗生素类药物均不能明显地诱导嗜热四膜虫细胞凋亡。但糖皮质激素类药物在含一定量的Ca~(2 )、Mg~(2 )离子时能诱导嗜热四膜虫发生凋亡。作者认为诱导嗜热四膜虫凋亡过程可能与糖皮质激素类药物诱导鼠胸腺细胞凋亡的机制是类似的,嗜热四膜虫与胸腺细胞的凋亡过程可能同样被Ca~(2 )、Mg~(2 )离子依赖性的核酸内切酶的活化机制所控制着。     

嗜热四膜虫SPO11基因缺陷型细胞株的基因表达变化分析

有性生殖的关键过程是通过减数分裂产生生殖细胞,而减数分裂的一个重要环节是进行基于DNA双链断裂的同源染色体重组。在同源染色体重组过程中,SPO11蛋白催化产生DNA双链断裂,从而起始同源染色体的重组。因此,研究SPO11基因缺失在减数分裂过程中所引起的基因表达变化有助于在转录组水平上了解该基因的作用。本研究通过对嗜热四膜虫(Tetrahymena thermophila)野生型和SPO11敲除细胞株在接合生殖时期2 h、3 h、4 h、5 h四个时间点的转录组进行高通量测序。通过差异表达基因分析和功能富集分析,发现SPO11基因敲除之后嗜热四膜虫在接合生殖时期2 h时,与DNA代谢过程和DNA复制相关基因的表达发生变化,推测SPO11基因敲除导致的减数分裂过程异常可能与DNA代谢过程和DNA复制相关。     

中华猕猴桃基因组可变剪接事件鉴定及分析

可变剪接使一个基因能产生多种m RNA成熟体,极大地增加蛋白多样性.采用中华猕猴桃基因组数据做参考数据,利用中华猕猴桃叶片和果实3个不同发育时期(未成熟、半成熟和成熟期)的转录组数据,从中华猕猴桃基因组(39040个基因)中共鉴定出11651个基因(占总基因数的29%)对应的32180个可变剪接事件.在可变剪接不同类型中,内含子保留类型的发生频率最高,占50%以上;3′可变位点类型频率约为5′端可变类型的2倍.GO富集分析结果表明,可变剪接的基因主要富集于酶调控及核苷酸结合相关功能的GO类别中,而组织特有可变剪接基因功能富集热点与组织的重要功能关联,叶片多为肌动蛋白及微管相关;未成熟果实与双组分信号系统相关;半成熟果实多与磷脂合成过程相关;成熟果实多与信号传递过程相关.另外,55.6%的维生素合成相关基因发生可变剪接事件,显著高于基因组水平的29.6%,暗示着可变剪接参与维生素合成相关基因代谢过程中的重要作用.通过对中华猕猴桃全基因组可变剪接的分析,为解析中华猕猴桃基因组及进一步开展相关分子育种工作提供依据.     

有机污染物二氯二苯三氯乙烷、三丁基锡和2，3，7，8-四氯二苯并二嗯英暴露下的四膜虫毒理基因组学研究

有机污染物二氯二苯三氯乙烷（DDT）、三丁基锡（TBT）和2,3,7,8．四氯二苯并二嗯英（TCDD）因对水生生态系统的危害以及对人体健康造成的严重伤害而受到重视．本实验以模式生物原生动物嗜热四膜虫为研究对象,利用microarray技术筛选了在上述3种污染物下分别暴露24h后差异表达2倍以上的基因,并在geneontology功能注释的基础上,通过富集分析考察了这些基因涉及的主要功能,其中许多功能和多细胞生物中的报道相一致．随后,以TCDD中富集功能注释的基因为核心,通过CLR算法构建了TCDD相关基因的相互作用网络,依照功能将其划分为2个亚网络,并在此基础上推测了TCDD在四膜虫中的作用机制模型．结果显示,四膜虫具有成为在基因组水平研究毒物作用机制的单细胞生物模型的巨大潜力．     

抗肿瘤多肽9R-P201诱导下的肝癌HepG2细胞转录组测序分析

旨在探索多肽9R-P201处理肝癌HepG2细胞后基因融合、单核苷酸多态性(Single nucleotide polymorphism,SNP)突变、可变剪接等事件,并分析差异表达基因所参与的生物学进程与信号通路,以期解析多肽9R-P201在转录组水平对肝癌细胞的调控。通过转录组测序检测9R-P201处理肝癌HepG2细胞前后基因差异表达情况,tophat-fusion软件检测基因融合,SAMTOOLS软件检测SNP位点,r MATS软件鉴定可变剪接,使用基因本体(Gene Ontology,GO)和京都基因与基因组百科全书(Kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG)富集分析方法对差异表达基因进行功能富集分析。结果共检测到可变剪接事件276个、SNP位点5 557个、基因融合事件45个;同时共得到显著差异表达基因403个,其中上调269个而下调134个,基因的功能富集分析结果显示差异表达基因显著富集细胞生长、迁移等肿瘤相关生物进程,并参与多条与癌症相关的信号通路。研究表明在9R-P201诱导HepG2细胞后,导致表达差异基因显著与肿瘤生物学进程和通路相关,并发生了大量可变剪接、SNP突变、基因融合等事件,这暗示着该多肽有望作为后续肝癌介入治疗潜在药物分子。     

真核基因可变剪接研究现状与展望

mRNA前体(pre-mRNA)的可变剪接是控制基因表达和产生蛋白质多样性的重要机制,是功能基因组时代的研究重点之一。生物信息学在识别可变剪接基因及其结构、分析可变剪接的功能和调控方式等方面具有重要作用。除了耗时的实验研究,识别可变剪接基因及其结构主要通过EST、mRNA等转录数据与基因组序列进行比对,获得同一基因的不同结构方式。分析蛋白质产物可对可变剪接的功能进行预测;潜在调控元件的统计分析则可为可变剪接调控机制的研究提供必要的数据。转录数据的时空信息以及比较基因组学对理解可变剪接信息的精确调控将提供重要资料。可变剪接及其调控机制的深入研究将为基因组和蛋白质组之间的对接提供重要的桥梁。     

浮萍棘尾虫Adss基因克隆及表达载体构建

为研究腺苷酸基琥珀酸合成酶(Adenylosuccinate synthase, 简称Adss)在原生动物中的作用, 对浮萍棘尾虫(Stylonychia lemnae)腺苷酸基琥珀酸合成酶Adss基因进行PCR克隆, 获得全长为1396 bp左右的序列, 其编码458个氨基酸, 保守结构域含有一个P-loop NTPase结构域, 蛋白结构预测Adss蛋白是由α-螺旋、β-折叠和无规卷曲组成的复杂结构。多重序列比对和系统进化分析显示浮萍棘尾虫Adss蛋白与第四双小核草履虫、多子小瓜虫和嗜热四膜虫等纤毛虫同源性较高。通过克隆浮萍棘尾虫Adss基因的启动子序列, 并采用增强型绿色荧光蛋白EGFP作为报告基因, 构建了启动子序列调控的表达载体pEGFP-N1-Adss, 通过转染细胞确定浮萍棘尾虫Adss蛋白定位于细胞质中。文章报道了原生动物纤毛虫Adss基因, 证实浮萍棘尾虫Adss蛋白属于典型的真核生物Adss, 为进一步揭示Adss在单细胞真核生物中的作用机制提供了新的参考。     

选择性剪接的理论预测

可变剪接作为真核生物转录后加工机制普遍存在于不同组织、不同发育时期或不同病理状态下的基因表达调控过程中。对同一基因不同剪接变体的研究可使我们更深入的了解发育、进化、疾病发生机理等基本的生物学问题。讨论了一些基于序列比对而建立的可变剪接的理论预测方法,尚存不足之处,有待于进一步完善。     

真核生物基因组转录诱导融合基因的研究进展

真核生物的基因组由基因和基因间区组成.基因转录时,从转录起始点开始到该基因的转录终止点结束,形成独立的转录单元.然而有少量的文献表明,转录有时会通读基因间区,产生包含上游基因、基因间区和下游基因的融合基因转录本.融合转录本经基因间剪接而成为有功能的成熟转录本.对真核生物转录诱导融合基因的基因间剪接方式、产生机制和意义进行了综述.     

鉴定9个新的RHD基因mRNA可变剪接体

为了研究各种RHD基因mRNA可变剪接体的基因结构, 应用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测正常人脐血样本RHD mRNA, 对RHD cDNA进行TA克隆和序列分析, 对各可变剪接体的剪接位点进行DNA序列分析, 并将RHD mRNA进行表达序列标签(ESTs)分析。结果在28个阳性克隆中, 除全长RHD cDNA外, 共检测到12种(包括9种新的)RHD可变剪接体, 发现外显子遗漏、5′和3′剪接位点变异3种剪接形式, 涉及外显子2~9, 其中6种新的剪接体同时存在RHD和RHCE基因同源杂交现象。ESTs分析还检索到内含子保留形式的剪接体。研究表明, RHD基因mRNA存在复杂的可变剪接机制, 除已报道的剪接体外, 检测到9种新的RHD可变剪接体, 并发现了可变剪接和同源杂交并存现象。