利用高效液相色谱法分离和测定棉花组织培养过程中4种内源激素

目的：优化利用高效液相色谱法测定棉花组织培养过程中吲哚-3-乙酸（IAA）、玉米素（ZT）、赤霉素（GA3）和脱落酸（ABA）等4种植物内源激素的条件,了解棉花胚性愈伤组织发生过程中4种内源激素及激素含量比例的规律性变化,以及添加不同外源激素对内源激素和愈伤组织的影响,为棉花组织培养由经验型变为理论型提供基础。方法：采用高效液相色谱法。结果：棉花胚性愈伤组织发生过程中4种内源激素及激素含量比例呈规律性变化：ZT、ABA、ABA/GA3、ABA/IAA呈现先上升后下降的趋势,GA3呈现先上升后下降再上升的趋势,ZT/IAA呈现明显的上升-下降-上升-下降的趋势;不同激素组合诱导下愈伤组织中内源激素含量及愈伤组织状态也有较大差别。结论：研究结果对指导组织培养过程中激素的调整和配比、制定适宜的培养计划有一定的指导意义;4种不同的内源激素都是愈伤组织生长的重要因子,各自适宜的浓度和恰当的比例调节着外植体的脱分化和再分化,各种激素协同作用促进细胞的生长和分化。     

陆地棉叶绿体铜锌超氧化物歧化酶基因的克隆与表达

以陆地棉‘CRI36＇的叶片为材料,使用RACE技术克隆到了棉花叶绿体Cu/Zn-SOD酶基因。基因序列全长共1 043 bp,含有完整的开放阅读框。推导的氨基酸序列分析显示含有叶绿体信号肽,和已知植物的叶绿体Cu/Zn-SOD酶蛋白的氨基酸残基的同源性在66%～74%之间。基因的表达谱分析显示：棉花叶绿体Cu/Zn-SOD酶基因主要在叶片、茎中表达,根、花和下胚轴中没有检测到信号,即基因的表达主要在棉花的绿色组织。不同生育期的表达谱结果证实：该基因主要在苗期表达,以后表达逐渐减少。用pET-21a（＋）构建了原核表达载体,在大肠杆菌BL21（DE3）的表达结果显示：表达后得到一个29.0 kD的新蛋白,其分子量与预期目标一致。对SOD酶活性的分析证实,重组菌的酶活性显著增加,证明克隆的基因具有活性。     

陆地棉子叶节高效再生体系的建立

对3个陆地棉材料子叶节进行离体培养,建立了高效的再生体系.其中,启动培养基为MSB+2.5 mg/L 6-BA +2.5 mg/LKT,芽分化培养基为MSB+0.3 mg/L 6-BA +0.3 mg/LKT,通过器官发生途径诱导形成丛生芽,芽伸长培养基MSB.以上培养基均含葡萄糖糖30 mg/L.此再生体系每个外植体可获得2.75个以上不定芽,嫁接移栽驯化后,成活率接近95%.     

鱼腥草组培体系优化及耐低温突变体的筛选

为解决豫北地区没有鱼腥草栽培,缺乏耐低温能越冬材料的需求,本实验以鱼腥草茎段为外植体进行不同植物生长调节剂及其浓度的组织培养诱导侧芽发生,优化了鱼腥草侧芽组织培养体系;使用不同浓度的甲基磺酸乙酯（EMs）诱变侧芽,诱导耐低温突变体,通过测定诱变材料可溶性糖含量、过氧化氢酶（CAT）和超氧化物歧化酶（SOD）活性变化鉴定材料耐寒性。结果表明茎段侧芽诱导的最佳植物生长调节剂组合培养基MS＋6-BA2．0mg·L-1＋NAA0．2mg·L-1;诱变处理的最佳组合为0．4％EMS处理6h,获得8株耐低温突变体;侧芽生根的最佳浓度组合为1／2MS＋NAA0．8mg·L-1。     

海岛棉与陆地棉叶绿素含量变化的差异研究

以5份陆地棉和4份海岛棉为材料,研究了整个发育进程中陆地棉和海岛棉叶绿素的变化规律之间的差异,结果显示：陆地棉与海岛棉的叶绿素a、叶绿素b和叶绿素a＋b各有不同动态变化规律,其叶绿素a/b在整个发育进程中的变化也有差异。海岛棉与陆地棉的叶绿素a变化趋势有较大差别,陆地棉的叶绿素a含量在6月18日（苗期）最高,峰值出现在8月6日,海岛棉峰值、最大值均在7月4日（现蕾期）;叶绿素b含量表现为陆地棉、海岛棉峰值均在8月6日（花铃期）,但海岛棉平均值高于陆地棉;陆地棉的叶绿素a＋b和叶绿素a曲线相似,海岛棉的叶绿素a＋b和叶绿素b曲线相似;陆地棉叶绿素a/b值表现苗期最大,然后迅速下降,海岛棉a/b值表现普遍低于陆地棉,其变化趋势为前期在7月4日出现峰值,然后下降再升高。实验说明陆地棉和海岛棉叶绿素的合成机制、调控机理可能不同。     

陆地棉超氧化物歧化酶基因的克隆与烟草转化

以陆地棉‘中棉所36’和烟草‘NC89’为材料,采用RT-PCR方法,从陆地棉中克隆到了Cu/Zn-SOD的cD-NA编码区,经植物表达载体pBI-SOD,导入根癌农杆菌LBA4404,对烟草叶片进行遗传转化,经卡那霉素筛选,获得正确的Cu/Zn-SOD的cDNA编码区,构建了转基因载体,并成功地获得2株转基因烟草;经PCR、Southern blotting和SOD酶活性等检测,证明Cu/Zn-SOD基因已经整合到烟草的基因组并表达。本试验结果为转基因棉花的进一步研究奠定了基础。