慢病毒介导的下丘脑中过表达miR-505小鼠模型的构建

目的:本文用慢病毒定点注射的方法构建了在下丘脑中过表达mi R-505的小鼠模型,并利用荧光原位杂交方法在冰冻切片组织上快速检测mi RNAs,以确认慢病毒载体介导的mi R-505在丘脑中的表达能力。方法:实验小鼠在脑立体定位仪下定位到下丘脑位置,采用原位注射的方式进行慢病毒注射,注射后采用实时荧光定量RCR和应用了LNA探针和TSA系统的FISH(fluorescence in situ hybridization)技术,完成在慢病毒介导的mi R-505过表达老鼠下丘脑区域细胞中的mi R-505检测和示踪。结果:mi R-505慢病毒注射未成年小鼠下丘脑区5、10、20和40天后,均可检测到mi R-505在下丘脑区域的表达,且实验结果表明在慢病毒介导的过表达小鼠下丘脑注射部位,mi R-505表达量有明显的提高。结论:利用慢病毒注射未成年小鼠下丘脑脑区的方法,成功的建立了下丘脑中过表达mi R-505的小鼠模型,使用LNA标记探针的FISH方法探索mi RNA表达规律较稳定,且重复率高。     

链球菌病类活疫苗活菌计数参考品的研制

研制链球菌病类活疫苗活菌计数参考品,可以更加科学地评价活菌计数结果的准确性和有效性。首先,制备了一批链球菌病类活疫苗活菌计数参考品,对其物理性状、纯粹性、真空度、剩余水分进行检验,并对其均一性、运输稳定性、热稳定性进行测定,另组织3家单位通过协作标定的方式对参考品活菌数进行赋值,用协作标定法统计参考品在12个月内的保存期。参考品的性状检查、纯粹检验、真空度测定和剩余水分测定结果均符合《中国兽药典》的规定;均一性试验结果显示,参考品计数结果的变异系数小于10%,均一性良好;运输稳定性试验证明,参考品在夏季和冬季用泡沫盒加冰袋的方式运输3日内数值仍能保持稳定;加速热稳定性试验验证,参考品在–20 ℃条件下保存3个月、4 ℃条件下保存21 d内均可活菌数稳定;通过协作标定,统计出参考品活菌数的赋值范围为 (8.5–12.1)×107 CFU/支;保存期试验结果证实,参考品在–70 ℃以下保存一年内活菌数可维持稳定状态。链球菌病类活疫苗活菌计数参考品,不仅可以为链球菌病类活疫苗的活菌计数实验提供参照物,而且可以用于评价马丁琼脂培养基的质量,为兽用生物制品质量控制提供保障。     

miR-92a-3p和miR-25-3p海绵上调Kiss1并影响雌性小鼠的青春期启动及动情周期

下丘脑Kiss1神经元产生的神经肽kisspeptin通过影响促性腺激素释放激素的分泌,参与青春期的启动、生殖系统的成熟以及排卵等过程的神经内分泌调节。Kiss1基因的表达受到包括多种反式调控因子及表观遗传的调控。预测与前期研究表明,miR-92a-3p、miR-25-3p的种子序列能够与Kiss1的3′-UTR直接结合,抑制Kiss1的表达。为进一步研究miR-92a-3p、miR-25-3p在Kiss1表达调控中的作用,本研究分别构建了对miR-92a-3p、miR-25-3p具有抑制作用的特异性吸附海绵载体：sponge-miR-92a和sponge-miR-25,以实现miRNA的功能缺失。流式细胞术和双荧光素酶报告基因系统分别证实,这2个海绵载体均能够非常有效地吸附外源性或内源性靶miRNA。sponge-miR-92a和sponge-miR-25载体被进一步包装成慢病毒LV-sponge-miR-92a和LV-sponge-miR-25。实时荧光定量PCR结果显示,经LV-sponge-miR-92a和LV-sponge-miR-25感染的下丘脑原代神经元细胞中,Kiss1表达水平均显著上调（P<0.05）;将LV-sponge-miR-92a注射到下丘脑后,雌性小鼠阴门开启时间明显提前（P<0.05）;下丘脑注射LV-sponge-miR-92a和LV-sponge-miR-25扰乱了雌性小鼠的正常动情周期。综上所述,成功构建了能够有效吸附miR-92a-3p、miR-25-3p的海绵载体,证明它们在解除miR-92a-3p、miR-25-3p对Kiss1的抑制中的作用,下丘脑注射海绵对雌性小鼠的阴门开启时间和动情周期均产生一定程度的影响,提示miR-92a-3p、miR-25-3p可能在青春期的启动和生殖成熟过程中发挥重要的作用。     

利用基于CRISPR-Cas9 的基因编辑技术对miR-29a在GT1-7 细胞中进 行基因敲除

目的:本文利用CRISPR-Cas9技术在GT1-7细胞中对miR-29a基因进行基因编辑,用于构建miR-29a基因敲除GT1-7细胞模型。方法:通过构建Cas9稳转的GT1-7细胞株并转染sgRNA质粒用于在靶向miR-29a基因区域引发突变。然后构建EGFP与sgRNA共表达质粒并转染Cas9稳转GT1-7细胞,利用流式细胞仪富集表达绿色荧光蛋白的阳性细胞和分选阳性单克隆细胞。最后利用实时荧光定量PCR(realtimefluorescencequantitativePCR)对富集细胞和单克隆细胞进行miR-29a表达量检测。结果:T7E1检测结果显示CRISPR-Cas9系统有效地在miR-29a基因区域引发了突变。荧光定量PCR结果显示,与对照组相比,富集后阳性细胞miR-29a的表达量整体下降了50%左右(P0.05)。此外,通过流式筛选获得了一个纯合miR-29a基因敲除细胞克隆,与对照组相比,其miR-29a的表达量下降了75%左右(P0.05)。结论:本文建立了一种有效编辑GT1-7细胞基因的方法,并采用该方法构建了miR-29a稳定敲除细胞模型。     

紫杉醇构效关系研究进展

紫杉醇是近40年从红豆杉属植物中发现的最著名的天然抗肿瘤药物,在过去30年多年间紫杉醇因其独特的结构、新颖的作用机制和显著的抗癌活性成为化学家、药理学家和生物学家的研究热点.本文对紫杉醇构效关系的研究进行了总结,提供参考文献85篇.     

辣椒素的提取及抑菌活性研究

以干红辣椒为原料,选取95%的乙醇和正己烷作为提取溶剂,利用索氏提取法提取其中的辣椒素。结果表明,以95%的乙醇作为提取溶剂的效果好于正己烷,辣椒素的提取率最高可达1.77%,高于正己烷的1.12%的提取率。用滤纸片法研究辣椒素对大肠杆菌等8种常见食品腐败菌的抑菌活性。结果表明:辣椒素对金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌有明显的抑菌效果,对大肠杆菌抑菌作用较弱,对黑曲霉、青霉、保加利亚乳酸杆菌和噬热链球菌没有作用。辣椒素经过高温灭菌后,抑菌作减弱,培养时间对抑菌圈的影响不大。以正己烷为助溶剂,确定辣椒素对枯草芽孢杆菌的最低抑菌浓度(MIC)为50mg/mL。     

多氯联苯降解菌的选育及降解性能研究

从长期受PCBs污染的土壤中筛选出2 株多氯联苯降解菌,并对其形态和生物学特性进行了观察研究。通过对这2 株菌的驯化筛选,得到混菌对PCBs的降解效果最好。通过改变菌株的降解条件（pH、温度、接菌量及装液量）可知,混菌的最佳降解pH 值为7.0、温度为30 ℃ 、接菌量为OD600nm=1.0的菌液2 mL、装液量为10.00 mL。在上述最佳条件下,混菌对10 mg/L的PCBs降解15 d,去除率可达70%左右。通过表面活性剂的增效降解作用研究可知,混合表面活性剂表现为低浓度（<500 mg/L）促进混菌对PCBs的降解,高浓度（>700 mg/L）抑制混菌对PCBs的降解。在降解体系中添加300 mg/L的混合表面活性剂,经16 d 的降解,可以将PCBs降解率提高到91.5%。     

单增李斯特菌感染致妊娠失败的研究进展

单增李斯特菌(Listeria monocytogenes, LM)是一种在自然界广泛存在的食源性人兽共患病原菌,妊娠动物和孕妇感染后会导致妊娠失败。研究显示,LM感染后随着血液循环到达胎盘,在其毒力因子(内化素A、李斯特菌溶血素O、肌动蛋白聚合蛋白、InlP蛋白等)的作用下,首先靶定绒毛膜外滋养层细胞,再穿过合体滋养层细胞或绒毛细胞滋养层细胞到绒毛基质,再通过胎儿毛细血管感染胎儿;在此过程中,LM诱导的胎盘细胞凋亡、母胎界面细胞因子表达水平的改变和胎盘细胞炎性体的激活导致了妊娠失败。该文对上述问题就国内外最新研究进展进行综述和探讨。     

利用CRISPR 系统介导人类mir-505基因位点的编辑

目的:通过针对人源mir-505基因,设计不同sgRNA,从而利用CRIPSR系统对mir-505基因位点进行编辑,并探讨CRISPR系统对靶点的剪切效率的影响因素。方法:针对人源mir-505基因设计两条具有不同GC%的sgRNA,随后分别将其构建入41824-sgRNA表达载体和42230-Cas9蛋白/sgRNA共表达载体,并将表达载体利用脂质体转染法转染入人类细胞,通过T7E1assay检测不同CRISPR系统对靶点剪切效率的影响。结果:对靶点的剪切与Cas9蛋白和sgRNA的剂量成正比;当sgRNA与Cas9蛋白共传递时,也能够明显提高靶点的剪切效率;而较低的sgRNA的GC%会降低其对靶点的剪切效率。结论:本研究利用CRISPR系统靶向人源细胞的mir-505基因,使得mir-505基因发生突变。CRISPR系统对靶点的剪切效率和sgRNA和Cas9蛋白的剂量、sgRNA是否和Cas9蛋白共传递以及sgRNA的GC%有关。