基因重组去整合素rAdinbitor对C6神经胶质瘤细胞FAK-Ras/MAPK通路的影响

rAdinbitor为大连医科大学生物化学与分子生物学教研室从旅顺产白眉蝮蛇毒腺中采用克隆技术得到的去整合素．之前研究已证明rAdinbitor具有抑制C6神经胶质瘤细胞增殖、促进C6神经胶质瘤细胞凋亡的作用．rAdinbitor对C6细胞作用的分子机制需要进一步研究．在此研究中,用E. coli BL21/pET23b-adinbitor表达rAdinbitor,通过Ni Sepharose 6 Fast Flow亲和层析柱对rAdinbitor进行纯化,纯化蛋白经Western blotting鉴定．用纤连蛋白(fibronectin,FN)诱导C6细胞．通过免疫沉淀和免疫印迹检测不同浓度的rAdinbitor对FN诱导的C6细胞中黏着斑激酶(FAK)、MEK1/2、Caspase-3的表达以及对FAK、ERK1/2活性的影响．研究表明：各实验组不同浓度的rAdinbitor均能明显降低FAK、MEK1/2的表达,对Caspase-3的表达起促进作用,并对ERK1/2的磷酸化有明显的抑制作用;除10 mg/L rAdinbitor对FAK磷酸化无明显抑制作用外,其余浓度的rAdinbitor对FAK的磷酸化起了明显抑制作用．这说明rAdinbitor对FAK及其下游Ras-MAPK传导通路的抑制在其抑制C6增殖过程中起了重要作用,Caspase-3表达升高提示,rAdinbitor可能通过抑制ILK及其下游的PI-3K/Akt途径起到了促进细胞凋亡的作用.     

拟南芥AtcpSecA基因表达的特异性

前期研究表明AtcpSecA基因的突变使叶绿体发育缺陷,内部缺少正常类囊体片层结构,叶片呈黄白色。在此基础上我们进一步研究AtcpSecA基因的表达特异性,并构建了AtcpSecA基因启动子与报告基因GUS的融合基因AtcpSecA：：GUS,以农杆菌介导方法转化获得转基因拟南芥。GUS组织化学染色结果表明,在AtcpSecA：：GUS转基因拟南芥的下胚轴、子叶、叶片、果柄等绿色组织中有很强的GUS活性,而在根、花序和种荚等非绿色组织中几乎没有GUS活性。降低培养基中琼脂浓度转基因拟南芥中AtcpSecA：：GUS基因的表达明显受抑制,暗中则显著受到促进。     

基质金属蛋白酶-2 C端片段PEX的原核表达及其对血管发生的抑制作用

为了克隆表达鸡的基质金属蛋白酶-2(MMP-2)的C端片段PEX,并探讨其对血管发生的抑制作用,利用RT-PCR从鸡胚成纤维细胞克隆MMP-2 C端片段PEX,构建原核表达载体pCal-n-PEX;转化大肠杆菌BL21(DE3)-pLys,异丙基β-D硫代半乳糖苷（IPTG）诱导产生PEX融合蛋白,包涵体蛋白用盐酸胍法变性、复性;生长曲线观察PEX融合蛋白对人脐静脉血管内皮细胞增殖的影响;鸡胚绒毛尿囊膜血管发生实验研究其对血管发生的抑制作用.结果表明融合蛋白CBP/PEX具有抑制人脐静脉血管内皮细胞的生长和鸡胚绒毛尿囊膜血管发生的作用.提示PEX是有待进一步开发的潜在抑制血管发生的药物.     

生长激素信号肽可诱导重组蛋白外分泌表达

重组蛋白质的表达是生物医药开发、基因功能和作用机理研究中关键技术环节.虽然细菌表达体系由于表达量大、经济等而被广泛采用,但由于其不能提供许多蛋白质必需的翻译后修饰如糖基化等,所表达的蛋白又多以不可溶包涵体形式存在,变性复性过程复杂,产率低,因此真核细胞表达体系如CHO、COS等成为活性要求高的蛋白质表达的首选[1].     

细胞周期特异性细胞凋亡的形态学观察

目的观察喜树碱诱导Molt-4细胞凋亡形态的细胞周期时相性变化,建立一种新的细胞周期特异性细胞凋亡分析方法.方法以凋亡诱导剂喜树碱(终浓度为0.15μmol/L)影响下的Molt-4细胞为检测对象,应用流式细胞术分析细胞凋亡及细胞周期的变化;用琼脂糖凝胶电泳的方法探测断裂的DNA片段存在,进一步证实细胞凋亡的存在;碘化丙啶(PI)染色后,再应用流式分选术结合激光扫描共聚焦显微镜(laser scanning confocal microsope, LSCM)观察各期细胞形态从而对已凋亡细胞进行形态学确认.结果①琼脂糖凝胶电泳可见清晰的DNA梯形条带(DNA ladder); ②喜树碱导致Molt-4细胞周期的S期水平明显下降,并伴随有一明显的细胞凋亡峰; ③只在S期细胞中可见到已凋亡细胞.以上说明喜树碱可以诱导Molt-4细胞凋亡,并细胞凋亡发生在细胞周期中的S期,与传统的结论一致.结论通过DNA直方图分选后细胞凋亡形态学分析可以对细胞凋亡的细胞周期特异性进行检测.这种方法使细胞周期特异性凋亡的分析更加可靠全面.