原核表达人MMP-2PEX片段对乳腺癌细胞BICR-H1的生长及转移的抑制

目的:克隆表达人源基质金属蛋白酶-2(MMP-2)的C－端类血红素结合域片段PEX,在鸡胚脲囊膜模型上研究PEX对血管发生,乳腺癌BICR-H1的生长及转移抑制作用。方法:构建人源PEX的原核表达载体pET-28a(+)-PEX-His,转化大肠杆菌BL21DE3-pLys,异丙基β-D硫代半乳糖苷(IPTG)诱导PEX蛋白;包涵体蛋白经尿素变性后,通过Ni-NTA 琼脂糖鏊合柱纯化、复性蛋白;观察其对人脐静脉血管内皮细胞增殖和鸡胚脲囊膜血管生长的影响;用带有绿色荧光蛋白(GFP)的腺病毒感染高转移人乳腺癌细胞BICR-H1,接种细胞到10日鸡胚脲囊膜上致瘤,通过静脉注射不同剂量PEX后,观察瘤重、体积和肺转移。结果:5~30μg经原核表达纯化的人PEX蛋白能有效抑制人脐静脉血管内皮细胞增殖能力,表现为时间和剂量依赖效应,并可抑制鸡胚脲囊膜血管发生。BICR-H1的生长及转移在10μg PEX作用时可得到有效抑制,30μg时则完全抑制,未见有肿瘤在接种部位的形成,更未观察到肺脏的转移灶。结论:原核表达纯化的人源PEX具有抑制血管生成、进而抑制乳腺癌BICR-H1细胞的生长和转移作用,是潜在的抗血管发生治疗肿瘤药物,有进一步研发价值。     

钙网蛋白122～180片段基因克隆、表达和活性分析

钙网蛋白是高等动物细胞中普遍存在的一种钙结合蛋白,近年发现它及其N端1～180位氨基酸能抑制内皮细胞生长和血管生成.为了寻找高效和小分子质量的血管生成抑制因子,用PCR技术扩增出钙网蛋白N端122～180位氨基酸的DNA序列,克隆进原核表达载体pET-3c,转化大肠杆菌BL21(DE3), 经IPTG诱导后,该片段以包涵体形式表达,表达量约占菌体总蛋白的35.4%.包涵体经变性溶解、复性和初步纯化后,纯化产物可以抑制人脐静脉内皮细胞的生长,鸡胚绒毛尿囊膜的血管生成和小鼠原位黑色素瘤的生长.     

原核表达Arresten蛋白抑制血管生成作用

目的:研究原核表达的Arresten蛋白纯化品对血管内皮细胞及血管生成的抑制作用。方法:MTT法检测Arresten蛋白对人脐静脉内皮细胞(HUVEC)增殖的影响;流式细胞仪分析Arresten蛋白作用下HUVEC凋亡的情况;细胞迁移实验观察Arresten蛋白对HUVEC迁移能力的影响;鸡胚绒毛尿囊膜(CAM)实验观察Arresten蛋白对新生血管的抑制情况。结果:原核表达的Arresten蛋白纯化品能特异性地抑制 HUVEC的增殖、迁移,诱导HUVEC的凋亡,并在一定范围内呈现出剂量—效应关系。Arresten蛋白能有效抑制鸡胚尿囊膜血管的生长(P<0.01)。结论:原核表达的Arresten蛋白纯化品对内皮细胞有特异的抑制作用,能有效抑制血管生成。     

血管内皮细胞生长因子受体Flt-1胞外区基因的克隆及其在中国仓鼠卵巢细胞中的表达

从原代培养的人脐静脉血管内皮细胞(HUVEC)提取细胞总RNA,采用逆转录PCR(RT-PCR)方法得到VEGF受体Flt-1胞外区前3个IgG样区域cDNA片段(Flt-1n3).将获得的受体基因克隆到真核表达载体pcDNA3.1中,得到重组质粒pcDNA3.1/Flt-1n3,通过脂质体转染方法将其转入中国仓鼠卵巢细胞(CHO),用G418筛选得到稳定表达目的蛋白的细胞克隆.经固相结合实验筛选得到表达与VEGF特异结合的目的蛋白的细胞克隆,细胞测活结果表明,表达产物具有抑制人脐静脉内皮细胞(HUVEC)增殖的活性.鸡胚测活结果表明,CHO细胞表达的r Flt-1n3能抑制鸡胚绒毛尿囊膜的血管形成.     

可溶型三聚体血管生长抑制因子Kringle5的克隆,表达,纯化及活性研究

血管生长抑制因子Kringle 5 是目前发现的抑制血管内皮细胞增殖和肿瘤生长的活性最强的纤溶酶原片段,特异性高而毒副作用小,在肿瘤的治疗方面具有潜在的巨大价值和广阔的应用前景。根据K5基因的序列设计PCR引物,通过PCR从已有的克隆载体扩增出人纤维蛋白溶酶原的K5部分基因,将K5基因克隆入原核表达载体pET15b,经序列测定,成功构建了pET15b-K5非融合表达载体。将重组载体导入大肠杆菌中IPTG诱导表达,SDS-PAGE分析目的蛋白主要以可溶形式存在于菌体中,破碎后上清通过阳离子交换层析,纯化获得纯度大于95%的目标蛋白,脱盐后对分子量测定推测形成了三聚体。通过鸡胚绒毛尿囊膜法证明蛋白产物对鸡胚绒毛尿囊膜血管增生有一定的抑制作用。     

新型埃博霉素衍生物对血管新生抑制作用的研究

研究新合成的新型埃博霉素单甲基衍生物对血管新生的影响,以期阐明埃博霉素在肿瘤细胞和血管新生中的效应及其所作用的重要途径,为药物新靶点的开发提供理论依据.首先,以人脐静脉内皮细胞为研究对象,利用MTT法检测细胞增殖,Transwell法检测细胞迁移和侵润,明胶酶谱分析金属基质蛋白酶MMP2的活性,RT PCR检测MMP2 RNA表达水平|然后以鸡胚绒毛尿囊膜为模型,研究该衍生物对血管新生的影响.结果表明:1）新型埃博霉素单甲基衍生物可以显著抑制人脐静脉内皮细胞HUVEC的增殖、迁移和侵润以及Ⅳ型胶原酶分泌; 2）新型埃博霉素单甲基衍生物可以使鸡胚尿囊膜产生明显的无血管区,对血管新生产生明显的抑制作用. 结果说明,新型埃博霉素单甲基衍生物可以通过抑制血管内皮细胞的增殖、迁移、侵润以及Ⅳ型胶原酶分泌等显著抑制诱导血管新生过程的步骤,最终抑制血管新生.     

人血管生成素cDNA的克隆与表达

血管生成素 ( angiogenin,ANG)广泛存在于多种肿瘤组织中 ,在肿瘤发生的不同阶段刺激新生血管的形成 .利用 RT- PCR方法从培养的人肺癌细胞系 A549扩增得到了 ANG c DNA片段 ,测序正确后克隆入融合表达载体 p RSETB中 ,构建了原核表达菌株 .经 IPTG诱导 ,表达了 N端融合His6的 ANG融合蛋白 ,表达量占菌体总蛋白的 1 0 % ,纯化后的血管生成素体外能够有效地刺激鸡胚绒毛尿囊膜的血管形成 .     

人血管生成素-PE40融合蛋白基因的构建、表达及活性研究

利用 PCR扩增出人血管生成素 (h ANG)成熟肽的基因片段 .与绿脓杆菌外毒素缺失突变体PE40的基因连接后 ,克隆入 p UC1 9载体中 .测序后克隆入表达载体 p RSETB,构建成 h ANG-PE40融合基因的表达载体 .IPTG诱导 ,表达出分子量约为 58k D的 His6- ANG- PE40融合蛋白 ,占菌体总蛋白的 8% .Ni2 +- NTA树脂纯化表达蛋白 ,SDS- PAGE结果显示纯化重组蛋白为单一条带 .鸡胚绒毛尿囊膜鉴定表明重组蛋白体外能够有效地抑制血管的形成 .     

靶向毒素DT-VEGF的构建、表达与活性分析

肿瘤的快速生长依赖于新生血管的形成。血管内皮生长因子（VEGF）是血管发生和形成过程中的主要介质,其特异性受体在正常组织和肿瘤组织的表达率存在数个数量级的差异,因此可以将毒素分子转运至增生的肿瘤上皮组织中抑制肿瘤血管增生,从而抑制肿瘤的生长。将白喉毒素的前389个氨基酸基因片段与VEGF165通过一短肽相连构建为融合蛋白基因,在大肠杆菌中表达,获得纯化蛋白。实验证实该融合蛋白对血管内皮细胞有特异性杀伤作用,并研究了其对鸡胚尿囊膜新生血管的抑制作用。     

白芨中萜类化合物通过诱导血管内皮细胞凋亡抑制血管生成

本文研究了白芨中的萜类化合物对血管生成的抑制作用．及其抑制血管生成的可能机制。采用萃取和色谱法从白芨中分离和纯化了该萜类化合物。通过鸡胚绒毛囊膜（CAM）和人脐静脉内皮细胞（HUVEC）研究了白芨中萜类化合物及其粗提物对血管及血管内皮细胞的抑制作用。结果表明,含该萜类的粗提物显著抑制鸡胚绒毛尿囊膜血管生成;该萜类纯品能明显抑制HUVEC增殖,且可诱导HUVEC凋亡,包括细胞体积缩小,细胞膜起泡,细胞核裂解,染色质浓缩和边集,出现凋亡小体,DNA降解。因此．白芨萜类化合物的抗血管生成作用与诱导血管内皮细胞凋亡有关。     

Expression of HSV-1 ICP0 antigen peptide in prokaryotic cells and preparation of specific antibody

As an immediate-early protein of herpes simplex virus, infected-cell polypeptide 0 (ICP0) exhibits complicated interactions with host cells, and its regulatory function on gene expression is of great importance. Since the ICP0 encoding sequence contains many rare codons which are absent in E.coli, and ICP0 is highly unstable in prokaryotic cells, expression of entire ICP0 in prokaryotic cells has never been reported. In order to further investigate the function of ICP0, a recombinant plasmid was constructed by subcloning a cDNA fragment encoding an amino-terminal of 105 residues of the ICP0 protein into pGEX-5x-1 vector. The resulting GST-105 fusion antigen peptide was expressed with high efficiency in E.coli. Antibodies prepared after the immunization of mice with purified fusion protein can recognize not only the denatured ICP0 protein, but also the native ICP0 protein with normal biological conformation. Foundation items: National natural science foundation items (30570081 and 30670094)     

A polypeptide from shark troponin I can inhibit angiogenesis and tumor growth

The shark troponin I gene (TnI) was found for the first time in this study to inhibit endothelial cell proliferation and angiogenesis. This shark TnI had 68.9% amino acid homology with human TnI, whereas the polypeptide from Lys91 to Leu123, which is thought to be the active site of TnI, had 78.8% homology with the corresponding fragment of human TnI. However, the polypeptide of shark had higher activity to inhibit the proliferation of HUVEC and tumor cell lines than that of human TnI. To investigate the anti-angiogenesis and anti-tumor effect of the shark TnI polypeptide, the DNA sequence of polypeptide (Lys91-Leu123) of white-spot catshark TnI(psTnI) was cloned and fused with the His-SUMO cDNA, followed by expression in Escherichia coli. After its purification by Ni²⁺ affinity chromatography, the fusion His-SUMO-psTnI protein was digested with the SUMO enzyme to release psTnI. The inhibitory ability of this recombinant shark TnI polypeptide for angiogenesis was confirmed by chicken embryo allantoic membrane (CAM) test and IHC analysis. It was also found by breast carcinoma xenograft study in Balb/c mice that this polypeptide could inhibit tumor growth in vivo.     

抗HBsAg-碱性磷酸酶双功能抗体分子的构建

为构建带有碱性磷酸酶活性的双功能基因工程抗体, 用PCR方法克隆大肠杆菌碱性磷酸酶基因, 通过酶切分析和DNA序列测定核实后,将其重组到抗乙肝表面抗原(HBsAg) Fab段的Fd羧基端,构建重组融合蛋白表达载体pHBFAP, 转化大肠杆菌XL1-Blue, 经异丙基硫代-β-D-半乳糖苷诱导表达后, 采用ELISA法检测到培养上清中存在与HBsAg的结合活性和碱性磷酸酶的催化活性, 显示抗HBsAg-碱性磷酸酶双功能抗体分子在大肠杆菌中获得了表达.     

血管内皮细胞生长因子受体Flt—1胞外区基因的克隆及其在中国仓？…

朋原代培养的人脐静脉血管内皮细胞（ＨＵＶＥＣ）提取细胞总ＲＮＡ,采用逆转录ＰＣＲ（ＲＴ－ＰＣＲ）方法得到ＶＥＧＦ受体Ｆｌｔ－１胞外区前３个ＩｇＧ样区域ｃＤＮＡ片段（Ｆｌｔ－１ｎ３）。将获得的受体基因克隆到真核表达载体ｐｃＤ－ＮＡ３．１中,得到重组质粒ｐｃＤＮＡ３．１／Ｆｌｔ－１ｎ３,通过南体转染方法将其转入中国仓鼠卵巢细胞（ＣＨＯ）,用Ｇ４１８筛选得到稳定表达目的蛋白的细胞砍隆。经固相结合实验筛选     

Direct binding of recombinant plasminogen kringle 1-3 to angiogenin inhibits angiogenin-induced angiogenesis in the chick embryo CAM

Angiogenin is one of the most potent angiogenesis-inducing proteins. Angiostatin is one of the most potent angiogenesis inhibitors, and it contains the first four kringle domains of plasminogen (K1-4). Recombinant human plasminogen kringle 1-3 (rK1-3) was expressed in Escherichia coli and purified to homogeneity. The binding of t-4-aminomethylcyclohexanecarboxylic acid with the purified kringle 1-3 was determined by changes in intrinsic fluorescence. rK1-3 exhibits comparable ligand-binding properties as native human plasminogen kringle 1-3. The purified rK1-3 inhibits neovascularization in the chick embryo chorioallantoic membrane (CAM) assay. Interaction of angiogenin with rK1-3 was examined by immunological binding assay and surface plasmon resonance kinetic analysis, and the equilibrium dissociation constants for the complex, K_d, are 0.89 and 0.18 μM, respectively. rK1-3 inhibits angiogenin-induced angiogenesis in the chick embryo CAM in a concentration-dependent manner. These results indicate that rK1-3 directly binds to angiogenin and thus rK1-3 inhibits the angiogenic activity of angiogenin.     

人vasostatin的克隆、表达、纯化及活性检测

从成人肝脏cDNA文库中,PCR扩增得到人vasostatin基因编码区序列,将此序列插入原核表达载体pQE30进行表达,SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)测定表明产物以包涵体形式存在,表达量占菌体总蛋白量的50%以上.包涵体洗涤后溶于8 mol/L尿素溶液,在变性条件下通过镍-氨三乙酸(Ni-NTA)金属螯合亲和层析柱进行纯化后,再经透析进行复性.N端氨基酸序列、分子质量、等电点等理化指标的测定结果与理论值相符.用内皮细胞增殖试验、内皮细胞迁移试验以及鸡胚尿囊膜血管生成试验等方法进行活性检测,证实复性的表达产物具有抑制内皮细胞增殖和迁移、抑制鸡胚尿囊膜血管生成的功能.     

人内皮抑素基因的克隆以及在大肠杆菌中的可溶性表达研究

用PCR的方法从人胎肝cDNA文库中得到人内皮抑素基因 ,克隆测序正确后连接到硫氧还蛋白融合表达载体上 ,转化大肠杆菌BL2 1 (DE3)得到表达人内皮抑素的工程菌。用IPTG诱导表达 ,表达量达到全菌蛋白的 64%。经分析硫氧还蛋白可以辅助内皮抑素可溶性表达 ,表达的融合蛋白保持了天然蛋白的免疫学特性。而且表面带有多聚组氨酸的突变的硫氧还蛋白还简化了蛋白纯化的步骤 ,使融合蛋白可以通过固相金属螯和层析 (IMAC)的方法纯化。纯化后的融合蛋白经IgA蛋白酶的切割可得到大小正确的重组人内皮抑素 ,用此方法获得的重组人内皮抑素可以在CAM试验中抑制新生血管的形成。高效可溶型表达内皮抑素的工程菌的构建成功 ,为内皮抑素的生产应用打下了良好的基础。     

重组小鼠canstatin N端片段对鸡胚新生血管生成的抑制作用(英)

为了研究重组小鼠canstatin N端片段的体内抗血管生成活性, 通过PCR扩增小鼠canstatin N端片段cDNA,定向克隆于原核表达载体pET30a(+)中,构建小鼠canstatin N端片段重组表达载体pET-mCanN, 转化E.coli BL21(DE3), IPTG诱导表达,SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和蛋白质印迹检测小鼠canstatin N端片段的表达. 结果表明,IPTG诱导原核表达载体pET-mCanN在大肠杆菌E.coli BL21(DE3)中高效表达, 小鼠canstatin N端片段表达量约占菌体总蛋白量的18%, 小鼠canstatin N端片段主要以包涵体形式存在,包涵体经过洗涤、裂解、Ni-spin column亲合柱层析以及蛋白质复性等步骤纯化后,获得了纯度约为92%的重组小鼠canstatin N端片段. 鸡胚绒毛尿囊膜(chicken embryo choriollantoic membrane,CAM)实验表明,原核表达的小鼠canstatin N端片段能有效地按剂量依赖的方式抑制鸡胚新生血管的形成.     

Expression and purification of soluble recombinant Human Endostatin in <Emphasis Type="Italic">Escherichia coli</Emphasis>

Endostatin, a 20 kDa C-terminal fragment of collagen XVIII, is a specific inhibitor of endothelial cell proliferation and angiogenesis. In the present study, we produced soluble and biologically active recombinant human endostatin (rhEndostatin) in Escherichia coli by expressing via fusion with solubility-promoting peptides and optimizing the expression conditions. The rhEndostatin was expressed via fusion with glutathione S-transferase (GST) and NusA protein, respectively. It revealed that NusA protein enhanced the production of soluble rhEndostatin; but GST didn’t. By optimizing the expression conditions, the production of soluble NusA-rhEndostatin fusion protein was about 50% of total cellular proteins and about 90% of the products appeared in the cellular supernatant fraction. The soluble NusA-rhEndostatin fusion protein was purified by one-step hydrophobic interaction chromatography and NusA was removed by thrombin. Then rhEndostatin was purified by affinity chromatography and gel filtration chromatography. As a result, a simple and economical purification procedure for rhEndostatin isolation was obtained. The biological activity of the rhEndostatin was demonstrated in vitro using a human vascular endothelial cells (HuVECs) proliferation assay. Our study provides a feasible and convenient approach to produce soluble and biologically active rhEndostatin.