云南傣族、汉族HLA-G基因14bp插入/缺失多态性研究

14bp插入/缺失多态性是指存在于HLA-G基因第8外显子3′非翻译区(3′UTR)的一个插入/缺失多态,因其能影响HLA-GmRNA的稳定性,并进一步影响HLA-G蛋白的翻译而受到广泛关注。文章采用PCR和电泳技术对云南傣族和汉族两个人群进行了HLA-G基因14bp插入/缺失多态性的检测分析,结果显示傣族和汉族人群+14bp等位基因频率分别为31.97%和40.87%,+14bp/+14bp基因型频率分别为8.20%和17.31%,+14bp/-14bp基因型频率分别为47.54%和47.11%。与国内外已报道的其他人群的数据比较表明:云南汉族群体中HLA-G基因14bp插入/缺失的分布与其他群体相似;傣族则有自己独特的基因型和等位基因分布特点,推测其可能受到了遗传漂变的作用,但不排除自然选择作用的影响。     

利用不同碳源进行毕赤酵母高密度发酵及TEF-1启动子指导下的HPV16_L1蛋白表达

目的:研究不同碳源对于毕赤酵母菌株在发酵罐中高密度生长,以及对组成型翻译延伸因子-1(TEF-1)启动子指导下HPV16_L1蛋白表达的影响。方法:利用1.5L发酵罐使用不同碳源进行毕赤酵母的高密度发酵,检测在不同碳源利用情况下菌体的增殖动力学,并以Western blot动态分析HPV16_L1蛋白的表达水平。结果:以甘油作为碳源,菌体细胞湿重可达到510g/L(OD600为189.4),HPV16_L1的表达在72h之前保持高水平;在甲醇和葡萄糖中菌体细胞湿重都可达到220g/L左右(OD600分别为75.3和77.3),甲醇利用下HPV L1蛋白在144h后仍保持较高水平表达,葡萄糖中60h HPV L1表达开始显著下降;在山梨醇作为碳源情况下菌体未能在发酵罐中获得高密度生长;总体上,甘油作为碳源在72h左右可获得最高的目的蛋白收获总量。结论:为实现毕赤酵母高密度生长与异源基因在TEF-1启动子指导下高效表达,以及HPV L1蛋白的简易、有效制备提供了基础。     

基于HPV16E7蛋白CTLs抗原肽的病毒样颗粒治疗性疫苗的构建

目的:构建呈递HPV16 E7 CTLs抗原表位的病毒样颗粒,并初步评价病毒样颗粒作为治疗性疫苗载体的潜能。方法:根据文献选择有效的HPV16 E7 CTLs表位,合成其正负链寡核苷酸序列,并通过退火形成双链DNA片段。将片段克隆于表达乙肝核心抗原的重组质粒p Thio His AHBc Ag,使抗原肽得以呈现于病毒样颗粒。重组菌经IPTG诱导后经SDS-PAGE鉴定目的蛋白表达。菌体破碎后经硫酸铵盐析法和蔗糖密度梯度离心进行纯化,并经高效液相凝胶过滤色谱和电镜鉴定病毒样颗粒的存在。制备的病毒样颗粒免疫接种了TC-1细胞的肿瘤模型小鼠,检测小鼠肿瘤大小。此外,在体外以抗原肽刺激脾细胞,以ELISA检测IFN-γ表达水平。结果:构建的三个重组表达质粒经酶切鉴定及测序分析证实构建正确。表达的重组蛋白大小与预期相符,并形成了病毒样颗粒。免疫小鼠后显示了抑制肿瘤增长的一定作用趋势。此外,抗原肽体外刺激促进了疫苗免疫小鼠脾细胞IFN-γ的表达,显示疫苗引起机体产生E7特异性的细胞免疫应答。结论:HBc Ag VLPs是有潜能的治疗性疫苗载体。     

云南HPV-16型E6、E7基因的突变分析

人乳头瘤病毒(Human papillomavirus,HPV)16型(HPV-16)是引起宫颈癌的一种主要高危型病毒,其2个致癌基因E6和E7的核酸序列变异可能会影响其对宿主细胞的致癌性,已有研究表明其序列突变呈现地域差异性。因此,研究不同地域HPV-16这2个基因的变化情况是宫颈癌流行病学调研的主要内容,也可为研究E6和E7的致癌性积累数据。研究以NCBI登录号为NC_001526.2的HPV-16型病毒的序列为参照,采用Neighbor-joining方法对云南地区74例HPV-16样本的E6、E7的DNA序列构建进化树,结果显示:只有亚洲和欧洲变异亚型,而没有发现非洲1、非洲2、亚-美洲和北美洲这4种变异亚型。DNA序列分析显示:E6的碱基突变以T178G(D25E,59.46%)和T350G(L83V,8.11%)为主,E7的碱基突变主要以A647G(N29S,59.46%)和T846C(同义突变,60.81%)为主。发现E6的新突变有A95G(同义突变,1.35%)和A135G(K11R,1.35%);E7的新突变有C625T(L22F,1.35%)、C627T(同义突变,12.16%)、G689A(G43E,1.35%)、T748G(S63A,1.35%)。此外还发现有一个共突变现象:T178G(D25E,59.46%)-A647G(N29S,59.46%)-T843C(同义突变,21.62%)-T846C(同义突变,60.81%)。     

乙肝核心抗原病毒样颗粒呈现HPV 16L1抗原表位及特异抗体诱导

目的:构建呈现HPV 16L1抗原表位的病毒样颗粒(VLPs),为新型HPV疫苗及特异抗体制备提供新的思路。方法:将编码HPV 16L1抗原表位QPLGVGISGHPLLNKLDDTE寡聚核苷酸片段克隆于HBc Ag基因编码第78、79位氨基酸序列之间,重组质粒转化大肠杆菌DH5α。重组蛋白经IPTG诱导后以SDS-PAGE分析表达情况,并以Western blot鉴定重组蛋白中HPV 16L1表位的免疫反应性。菌体超声破碎后经硫酸铵盐析法和蔗糖密度梯度离心进行纯化,并经凝胶层析Sepharose G25脱盐,最后以电子显微镜及高效液相(HPLC)凝胶过滤色谱鉴定VLPs的存在并分析纯度。纯化的病毒样颗粒分别于0周、2周、4周经皮下注射免疫BALB/c小鼠,以Western blot分析血清特异识别L1蛋白的能力。结果:HBc Ag/L1肽嵌合蛋白获得成功表达,能够被商业化L1抗体特异识别,经密度梯度超速离心及HPLC分析显示其与HBc Ag行为一致,电子显微镜观察进一步确定其以HBc Ag病毒样颗粒形式存在。VLPs免疫小鼠获得的抗血清能够特异识别酵母表达的重组L1蛋白。结论:HBc Ag VLPs成功呈现HPV16L1蛋白并有效激发特异抗体应答。     

HPV16型基因变异与宫颈癌发生相关性的研究进展

宫颈癌是女性常见肿瘤之一,严重影响女性健康.研究发现,高危型人乳头瘤病毒感染是宫颈癌发生的重要因素之一.HPV16型是最为常见的一种高危型人乳头瘤病毒,其基因组变异可能具有更大的致癌潜能.本文主要针对HPV16基因型各个区域常见的突变位点与宫颈癌的关系做一总结叙述.     

埃博拉病毒GP和VP40蛋白在哺乳动物细胞中的共表达及病毒样颗粒装配

目的：制备基因重组埃博拉病毒样颗粒,为疫苗研究及埃博拉病毒特异抗原、抗体检测提供基础。方法：根据埃博拉病毒扎伊尔株的GP和VP40蛋白氨基酸序列,以哺乳动物细胞基因表达密码子偏好性进行基因优化设计;化学合成GP和VP40基因片段并分别构建于表达质粒pcDNA3.1或同时构建到具有双表达单元的质粒pBudCE4.1;重组质粒经lipofectamine2000转染293FT细胞;以Western blot检测重组蛋白GP和VP40的表达;通过电镜观察病毒样颗粒。结果：构建的重组质粒经酶切鉴定及测序分析证实构建成功;Western blot结果显示,共转染分别表达GP和VP40的两个质粒或转染共表达两个蛋白的质粒都发现GP特异反应条带产生,且大小与预期相符,此外,转染共表达质粒产生的GP蛋白表达明显强于两个质粒共转染,并同时可检测到VP40的表达;电镜观察到典型的丝状的埃博拉病毒样颗粒。结论：在293FT细胞中基因优化的埃博拉病毒GP和VP40可有效表达并装配为病毒样颗粒,为进一步研究奠定了基础。     

中国壮族和裕固族群体HLAⅠ类区域Alu插入多态性及其与HLA-A位点的相关性

近年来研究发现: 位于HLAⅠ类基因区域的Alu插入是研究不同群体HLAⅠ类基因区域祖先单倍型和HLAⅠ类基因多样性产生、进化和重组的理想工具。文章对中国壮族和裕固族群体HLAⅠ类基因区域5个Alu插入多态性(AluMICB、AluTF、AluHJ、AluHG和AluHF)进行研究, 结合HLA基因分型数据, 分析壮族、裕固族、哈尼族、布朗族和傣族5个民族群体中Alu插入与HLA-A等位基因的关系。研究结果显示: (1)壮族和裕固族人群中5个Alu插入频率范围分别为1.5%~35.8%和9.2~34.8%, AluMICB、AluTF和AluHF插入频率在这两个群体中有统计学差异(P<0.05); (2)在5个研究的群体中, AluHG插入与HLA-A*02的不同亚型关联; AluHJ插入与HLA-A*2402在5个群体中都关联, 但AluHJ与HLA-A*1101和HLA-A*2407只在布朗族中关联。表明不同群体HLAⅠ类基因区域内Alu插入具有各自的特征, 且Alu插入与不同的HLA-A等位基因相关联。这种Alu插入及其与HLA-A的关联特征可作为研究群体中HLAⅠ类基因和单倍型系谱变化的重要遗传标记。     

中国4个民族群体HLA-G基因14bp插入/缺失多态的分布特征及其HLA-A位点的相关性

近年来,位于HLA-G基因第8外显子3′UTR的一个14 bp插入/缺失多态位点与复发性流产、自身免疫性疾病和肝癌等疾病相关而引起广泛关注。本实验室前期的研究表明,不同群体的HLA-G基因14 bp插入/缺失频率具有群体语系分布特点。文章对土族、裕固族、傈僳族和怒族进行HLA-G基因14 bp插入/缺失的基因分型,结合HLA-A基因分型数据,分析土族、裕固族、傈僳族和怒族4个民族群体中14 bp插入/缺失与HLA-A等位基因的关系。研究结果显示:(1)尽管HLA-G基因14 bp插入频率在不同群体中的分布具有各自群体的特点,但遵循着按语系及语族分布的规律,除汉藏语系汉语族与阿尔泰语系蒙古语族无差异外,语族间差异明显;(2)不同群体中,14 bp插入与不同的HLA-A等位基因相关联。