抗P-选择素凝集素-EGF功能域单抗对人树突状细胞成熟及功能抑制作用分析

在发现抗P-选择素凝集素-EGF功能域单抗(PsL-EGFmAb)对体外培养人树突状细胞(DC)成熟及功能有抑制作用基础上,进一步观察了PsL-EGFmAb对DC干预调节的作用机制。通过SCF、GM-CSF、TGF-β1、Flt-3L和TNF-α体外培养体系,从脐血CD34 造血干细胞中诱导扩增获得DC,并于成熟过程中用PsL-EGFmAb进行干预。采用流式细胞仪检测细胞表面分子表达;RT-PCR检测细胞内NF-κBp50、NF-κBp65mRNA表达;MTT比色法检测T细胞增殖反应,以及ELISA法测定IL-12p70分泌的含量。结果显示,PsL-EGFmAb对DC表面特异性C型凝集素DC-SIGN(CD209)表达有抑制作用,同时也能抑制DC细胞内NF-κBp50、NF-κBp65mRNA表达,相应抑制其黏附共刺激分子CD11c、CD83、CD80、CD86表达,以及IL-12p70分泌,此外也可抑制DC体外刺激T细胞增殖的能力。研究结果表明,PsL-EGFmAb对DC成熟及功能的抑制作用,提示与其抑制作为DC模式识别受体及功能分子DC-SIGN有关,并可能是通过影响NF-κB信号途径起作用。     

RNA干扰抑制肾小管上皮细胞TSP1表达和TGF-β1活化

血小板反应蛋白1(TSP1)是转化生长因子-β1(TGF-β1)体内重要的活化因子,而后者又是致肾小管间质纤维化的关键因素。观察了针对TSP1的小双链干扰RNA(siRNA-TSP1),抑制由血管紧张素II(AngII)诱导的肾小管上皮细胞TGF-β1过度活化。将根据人TSP1基因序列设计的特异siRNA-TSP1转染人肾小管上皮细胞系(HK-2),利用Western印迹、RT-PCR、流式细胞仪及ELISA等方法,检测了TSP1、TGF-β1及其信号蛋白Smad2与p-Smad2、纤维连接蛋白(FN)和纤溶酶原激活剂抑制物-1(PAI-1)的基因转录水平、蛋白质表达或蛋白质活性。结果显示,siRNA-TSP1能有效转染HK-2细胞,并以剂量依赖方式显著抑制TSP1的基因转录与合成;其对TGF-β1的合成影响较小,但能明显抑制TGF-β1的活化。此外siRNA-TSP1可阻抑TGF-β1依赖的Smad2磷酸化,减少细胞外基质FN以及PAI-1的合成。研究结果提示,由于TSP1是TGF-β1重要的内源性活化因子,故针对TSP1的RNA干扰能在体外有效抑制TSP1表达并相应调抑了TGF-β1的活化。     

协同刺激分子与疾病

在T细胞表面受体中,除TCR外,协同刺激分子在调节T细胞的免疫反应中起关键性作用,目前较熟悉的协同刺激分子及其配体有：CD40／CD40L、B7—1／B7-2-CD28／CTLA-4、ICOS—B7RP-1。最近人们又发现了CD2-LFA3、CD5-CD5L、4—1BB／4—1BBL、HAS等新的协同刺激分子组合,它们在器官移植、肿瘤治疗、自身免疫病的治疗方面有重要作用;在基础研究中则可用于T细胞与B细胞分化、活化机制、抗原递呈、协同刺激机制、免疫耐受、移植排异反应和自体免疫等的研究。     

树突状细胞在肾小管间质纤维化中作用及缬沙坦的干预调节

探讨树突状细胞(DC)在肾纤维化大鼠肾小管间质中分布,以及缬沙坦对DC浸润聚集的干预作用。建立肾大部切除大鼠模型,随机分为正常组(n=18),假手术组(n=18),模型组(n=18),缬沙坦治疗组(n=18)。分别于建模1、4、12周取肾组织,采用HE和Masson染色评定各组肾小管间质纤维化(TIF)程度;采用免疫双染及荧光图像分析法,观察DC-SIGN DC在各组大鼠肾组织中分布变化;采用免疫组化方法,观察P-选择素以及TGF-β1、α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、III型胶元(ColIII)、纤维连接蛋白(FN)在上述肾组织中表达;以及RT-PCR检测P-选择素、TGF-β1、α-SMA、ColIII、FN的mRNA水平。结果显示,(1)模型组DC-SIGN DC主要分布于肾小管、肾间质和肾血管,以肾间质最为明显;其分布数量于12周较1和4周呈明显增多,且与慢性肾功能减退呈正相关。(2)12周时手术组大鼠肾小管间质区P-选择素、TGF-β1、α-SMA、ColIII、FN mRNA转录水平和蛋白质表达均明显增加,并与TIF程度以及DC-SIGN DC分布数量呈正相关。(3)经缬沙坦治疗后,DC-SIGN DC分布减少,以及P-选择素、TGF-β1、α-SMA、ColIII、FN mRNA转录水平和蛋白质表达下降,TIF程度减轻及肾功能改善。研究结果表明,DC启动参与了肾小管间质纤维化形成,并与肾功能损害程度密切相关。缬沙坦对此具有明显的抑制和肾脏保护作用。     

树突状细胞C型凝集素DC-SIGN在人肾炎组织和肾小管上皮细胞表达

DC-SIGN(DC-specificICAM-grabbingnon-integrin,亦称CD209)属树突状细胞(DC)表面C型凝集素的膜蛋白。作为DC黏附及模式识别受体,其参与介导了DC的炎症组织迁移,识别捕获病原微生物,以及随后激活静息T细胞启动的免疫应答。为此观察了DC-SIGN及DC-SIGN DC在肾炎患者肾组织中表达和分布,以及DC-SIGN在炎性状态下培养人肾小管上皮细胞表达,探讨与肾小管间质炎症病变和损伤的关系。结果显示,DC-SIGN在正常肾组织基本不表达,而在肾炎早期即以肾小管上皮细胞为主表达上调,且随肾小管间质病变程度加重表达增强(P<0.01),与肾小管间质病变程度明显相关(P<0.01)。此外,DC-SIGN在经TNF-α刺激炎性状态下的人肾小管上皮细胞也明显表达。进一步发现,DC-SIGN DC在肾炎早期以肾间质为主分布聚集,也随肾小管间质病变程度加重明显增多(P<0.01),与肾小管间质病变程度显著相关(P<0.01),也与DC-SIGN表达相关联(P<0.01)。另外,DC-SIGN DC在肾小管间质分布数量与肾炎患者肾功能改变明显相关(P<0.05)。研究结果提示,DC-SIGN也是肾小管间质早期炎症的启动参与因素,其介导DC可能也参与了人肾炎肾小管间质的免疫损伤机制。     

人DC体外分化成熟特性及抗P-选择素功能域单抗对其干预调节

结合树突状细胞(DC)生物学特性, 探讨抗P-选择素lectin-EGF功能域单抗(PsL-EGFmAb)对体外培养人DC成熟和功能干预调节的作用. 通过SCF, GM-CSF, TGF-β₁, Flt-3L及TNF-α体外培养体系, 从脐血CD34⁺造血干细胞中诱导扩增获得DC, 并于细胞成熟过程中用PsL-EGFmAb及辅以IL-10作为对照进行干预. 分别观察和检测DC形态学及细胞活力, 细胞表面分子HLA-DR, CD1a, CD11c, CD54, CD83, CD80, CD86, CD209(DC-SIGN)及CD62P, E, L(P-、E-、L-选择素)表达, 细胞内活性氧(ROS)水平, 及IL-12p35, p40 mRNA与NF-κBP50, P65 mRNA表达, 培养上清液中IL-12p70分泌含量, 以及DC体外对T淋巴细胞刺激能力, 以此分析PsL-EGFmAb 对DC成熟与功能的干预状况. 结果显示, 未成熟DC高表达属模式识别受体的C型凝集素DC-SIGN外, 且胞内蓄积适量ROS, 具备了细胞吞噬能力. 成熟DC除仍高表达DC-SIGN, 伴随细胞内NF-κB基因明显表达, 其表面黏附共刺激分子CD11c, CD83, CD80, CD86表达上调, 且细胞因子IL-12合成分泌增加, 并具明显的体外刺激T淋巴细胞增殖能力, 符合于抗原提呈细胞特征. 此外, 未成熟和成熟DC基本不表达P-, E-选择素, 而分别高表达和低表达L-选择素. 进一步发现, PsL-EGFmAb较对照IL-10对DC表面DC-SIGN表达有抑制作用; 也能抑制细胞内NF-κB基因表达, 并相应抑制或下调DC黏附共刺激分子CD11c, CD83, CD80, CD86及HLA-DR表达, 抑制IL-12基因转录及其合成分泌, 以及抑制DC体外刺激T细胞增殖的能力. 上述结果表明, PsL-EGFmAb对DC分化成熟及功能具有抑制作用, 提示此作用与其抑制作为DC模式识别受体及功能分子DC-SIGN有关, 并可能是通过影响NF-κB信号途径起作用.     

DC-SIGN与免疫调节

树突状细胞(DC)是目前所知体内功能最强大的专职抗原递呈细胞,它既能启动初始免疫应答,也能负向调控免疫反应,具有独特的免疫调节功能。DC-SIGN属于DC表面C型凝集素受体超家族成员,它既是DC病原体模式识别和黏附受体,又作为DC特征性多功能免疫分子,参与DC免疫调节作用。DC-SIGN在调节DC黏附迁移及炎症反应,激活初始T细胞及启动免疫应答,以及病原体与肿瘤的免疫逃逸等诸多方面发挥重要作用,已日益受到人们的关注。而对DC-SIGN在天然免疫和获得性免疫中调节作用及其相关机制的更深入研究,可为临床相关疾病机制探讨与防治进一步提供新的有力依据和干预途径。