中国南海堂皇芋螺毒素基因克隆及两个毒素的合成及活性研究

目的 研究中国南海堂皇芋螺(Conus imperialis)毒素基因序列,为毒素功能研究奠定基础。方法 采用Trizol法提取堂皇芋螺毒腺管的总RNA,应用3’端快速扩增cDNA末端(3’RACE)及巢式PCR技术,获得A、O、J超家族芋螺毒素新序列;或以A家族高度保守的内含子及3’端非翻译区(3’UTR)设计引物,克隆出新的α-芋螺毒素新序列。选择合成毒素ImIIA及Im1.2,测定ImIIA二硫键的连接方式,并测定两种毒素对神经型烟碱乙酰胆碱受体(nAChR)的抑制活性。结果 获得11条毒素前体肽序列,分属A、O1、O2、J3等超家族,其中Im1.95为已报道芋螺毒素,其余为新发现芋螺毒素。ImIIA二硫键连接方式为少见的“C1-C2,C3-C4”,10μmol/L Im1.2、ImIIA对α2β2、α2β4、α4β2、α3β2、α3β4 5个nAChR亚型抑制活性较低。结论 通过基因克隆方法,从堂皇芋螺中获得了11个芋螺毒素,其中10个为新序列,属于A、O1、O2、J3等超家族毒素,Im1.2、ImIIA对神经型nAChR各受体亚型活性较低。     

新型α-芋螺毒素Di1.1的克隆、合成及功能研究

目的：从中国南海长距芋螺中克隆出新的芋螺毒素序列并用固相方法合成该毒素,测定其折叠后的二硫键配对方式并初步研究其药理学特性。方法：根据芋螺毒素A超家族保守的信号肽序列设计引物,通过3＇-RACE扩增,从芋螺毒腺管中克隆出新的毒素基因;采用Fmoc-固相法合成线性多肽,通过空气氧化折叠获得含二硫键的折叠产物,用两步氧化折叠法测定多肽的二硫键连接方式;用双电极电压钳技术初步研究其药理学特性。结果：发现-种新的α-芋螺毒素Dil．1的cDNA序列,其成熟肽序列为CcVIESCHSNHIDECES;该肽二硫键连接方式以C1-C4、C2-C3为主,以C1-C3、C2-C4连接为辅,对烟碱型乙酰胆碱受体各亚型活性较弱。结论：Dil．1是-种新的α4／7型芋螺毒素,其折叠方式以C1-C4、C2-C3连接为主。     

新的J超家族芋螺毒素的克隆与进化分析

目的:从中国南海芋螺中克隆新的J超家族芋螺毒素,并进行序列和进化分析。方法:以芋螺毒腺管总RNA为模板,采用3′-RACE及巢式PCR的方法扩增J超家族芋螺毒素基因,并将得到的目的基因与pMD18-T载体连接并转化大肠杆菌DH5α,经测序比对后,获得新的J超家族毒素,利用软件BioEdit、ClustalX及Mega5.05进行进化分析。结果:获得12个新的J超家族芋螺毒素前体肽序列,其氨基酸组成具有新颖性,在进化树上与已报道的J超家族毒素处于不同的进化分支。结论:12个新的J超家族毒素与已报道的毒素序列之间的同源性较低,是J超家族新成员。