鼠伤寒沙门菌VI型分泌系统效应因子Rhs生物学特性分析

【背景】细菌的Ⅵ型分泌系统作为杀死真核捕食者或原核竞争对手的“武器”,其杀伤作用是通过释放有毒物质即效应因子来实现。尽管已发现一些效应因子,但大多数效应因子的功能仍然未知。【目的】研究rhs基因编码的效应因子Rhs对鼠伤寒沙门菌生物学特性的影响。【方法】利用Red同源重组的方法构建鼠伤寒沙门菌rhs基因缺失株及相应的基因回补株。通过试验分析比较亲本株与缺失株、回补株在生化特性、生物被膜形成、耐药性、细菌间竞争、抗血清补体杀菌能力、组织载菌量及感染小鼠后炎症因子IL-18、IL-1β释放量上的差异。【结果】效应因子Rhs不影响鼠伤寒沙门菌的生化代谢、生物被膜形成、耐药性及抗血清补体杀菌能力。细菌种间竞争试验中,基因缺失株CVCC541Δrhs1、CVCC541Δrhs2和CVCC541Δrhs1-2的竞争指数(competition index,CI)值分别为0.85、0.77和0.87,毒力均被轻度致弱。体内组织载菌量试验中,CVCC541Δrhs1、CVCC541Δrhs2和CVCC541Δrhs1-2基因缺失株在小鼠肝脏和脾脏中的细菌数均较亲本株明显下降(P<0.05);机体...     

鼠伤寒沙门氏菌Ⅵ型分泌系统相关基因敲除及其功能特性

Ⅵ型分泌系统(T6SS)是大多数革兰氏阴性细菌中都存在的一种重要的分泌系统,能介导细菌与细菌之间以及细菌和宿主细胞之间的相互作用,溶血素共调节蛋白(Hcp)和缬氨酸甘氨酸重复蛋白G(VgrG)是组成T6SS穿刺装置的重要组分。但鼠伤寒沙门氏菌Ⅵ型分泌系统的Hcp与VgrG在该菌入侵宿主细胞及抗吞噬过程中发挥的作用尚不十分清楚。【目的】本研究旨在利用基因敲除技术构建的鼠伤寒沙门氏菌hcp及vgrg基因缺失株体外接种真核上皮细胞和巨噬细胞,并以其亲本株作为对照,以研究Hcp及VgrG在该菌粘附、侵入上皮细胞及抗吞噬过程中所发挥的作用。【方法】通过优化Red同源重组系统操作过程中各个条件,建立一套快速敲除鼠伤寒沙门氏菌Ⅵ型分泌系统相关基因的操作系统,成功构建鼠伤寒沙门氏菌CVCC541的hcp及vgrg单基因缺失株、双基因缺失株及三基因缺失株,并用Hela细胞接种试验和菌落计数试验,评估不同菌株的粘附和侵袭能力;用小鼠巨噬细胞RAW 264.7接种试验,评估不同菌株的抗吞噬能力。【结果】与亲本株CVCC541粘附侵袭Hela细胞相比,基因缺失株CVCC541Δvgrg、CVCC541Δhcp2Δvgrg和CVCC541Δhcp1Δhcp2Δhcp3的粘附率分别为17.17%±2.1%、14.73%±2.5%和82%±3.7%;CVCC541Δvgrg、CVCC541Δhcp2Δvgrg和CVCC541Δhcp1Δhcp2Δhcp3的侵袭率分别为7.05%±1.05%、6.21%±1.35%和87%±3.25%;与亲本株CVCC541在小鼠巨噬细胞RAW 264.7中的存活相比,基因缺失株CVCC541Δvgrg、CVCC541Δhcp2Δvgrg和CVCC541Δhcp1Δhcp2Δhcp3的存活率分别为15.67%±2.9%、14.47%±1.87%和56.12%±3.48%。【结论】鼠伤寒沙门氏菌Ⅵ型分泌系统VgrG和Hcp对该菌入侵细胞和抗吞噬方面具有重要作用,该研究为鼠伤寒沙门氏菌通过六型分泌系统与宿主细胞相互作用的机制研究奠定了基础。     

猪源冠状病毒TGEV中国分离株纤突蛋白生物信息学分析

以猪源冠状病毒(Porcine coronavirus) TGEV 纤突蛋白基因序列为基础,利用生物软件对TGEV中国分离株纤突蛋白进行N-糖基化位点、跨膜螺旋、进化树、二级结构及抗原位点的预测和分析.结果显示所有TGEV毒株可分为3个基因型,4株中国分离株分别归属于以上3个基因型,属于Ⅰ型的中国株TSX在跨膜螺旋的氨基酸及二级结构上与其他中国株有明显的差异,而同属于Ⅲ型中国毒株SC-Y和TH- 98在跨膜螺旋的氨基酸及二级结构上非常接近,而所有中国分离株抗原表位没有明显差别,表明TGEV在中国没有显著的变异.     

乙肝疫苗的研究进展

乙型肝炎是由乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)引起的传染性疾病,流行范围广泛,危害严重。目前,乙型肝炎的预防和治疗主要通过接种乙肝疫苗。现针对乙肝疫苗的类型及其免疫学作总结,为乙肝疫苗的深入研究提供参考。     

猪源冠状病毒聚合酶基因的克隆及特性分析

参照GenBank中Purdue株序列对TGEV TS株聚合酶基因(ORF1)设计特异性引物,经RT-PCR扩增获得了20054bp的片段,与预期大小相符.TS株与Pur46-MAD株的ORF1核苷酸和氨基酸序列同源性分别为98.8%和99.0%,与FIPV、PEDV、HCV299E及SARS氨基酸同源性分别为88%、57%、57%和45%.不同冠状病毒比较结果显示RdRp有很高的保守性而且有重要的作用,序列分析标明TS株在ORF1a和ORF1b重叠区有核糖体剪切位点UUUAAAC,且相应区域RNA二级结构形成3个茎环结构.     

猪戊型肝炎病毒swCH-GS189株ORF2基因的克隆及序列分析

为进行猪戊型肝炎病毒(HEV)ORF2基因特征研究,参照GenBank中已发表的戊型肝炎病毒(HEV)核酸序列,设计了一对扩增HEV ORF2基因的引物,利用RT-PCR等方法克隆出了一株猪戊型肝炎病毒甘肃分离株GS189的ORF2基因cDNA片段.序列测定结果表明,swCH-GS189株的ORF2基因长2 025 bp,编码674个氨基酸,与GenBank中公布的其它毒株间的核苷酸序列同源性为79.1%～91.8%,推导的氨基酸序列同源性为89.5%～98.8%.系统发育进化树结果表明,该分离株为基因IV型.     

颗粒溶素和穿孔素真核共表达及其对A549细胞的影响

目的：克隆人颗粒溶素和穿孔素基因并构建真核表达载体pGNLY-2A-PFP,观察其在人肺癌A549细胞中的表达情况。方法：体外分离培养外周血单个核细胞并抽提总RNA,RT-PCR扩增人颗粒溶素和穿孔素的基因片段,并将其分别插入pMD18-T进行测序,鉴定正确后构建pIRES-GNLY、pIRES-PFP及pGNLY-2A-PFP并转染人肺癌A549细胞,RT-PCR和间接免疫荧光检测目的蛋白表达,流式细胞Annexin V/PI检测转染后细胞凋亡情况。结果：成功获取了人颗粒溶素和穿孔素cDNA,构建了真核表达载体pIRES-GNLY、pIRES-PFP、pGNLY-2A-PFP,转染A549细胞后检测出了目的蛋白的表达,pGNLY-2A-PFP转染组细胞死亡率高于其他对照组（P<0.05）,死亡细胞以凋亡为主。结论：人颗粒溶素和穿孔素基因可以在人肺癌A549细胞中表达,二者共表达能够促进细胞凋亡,这将有助于颗粒溶素和穿孔素在肿瘤治疗中应用的后续研究。     

猪γ-干扰素的克隆表达及单抗的潜在应用

以刀豆素A(ConA)刺激长白猪外周血单个核细胞(PBMC),提取的总RNA为模板,采用一步法RT-PCR扩增出包含猪γ-干扰素(PoIFN-γ)完整基因的片段。将完整的PoIFN-γ基因亚克隆到pET-32a(+)上,构建pET-IFN-γ融合表达载体,转化入Rosetta(DE3)后IPTG诱导表达,得到大小约为36.8kD的目的蛋白。将目的蛋白检测及纯化后免疫后BALB/c小鼠,取脾细胞与SP2/0细胞融合,最终筛选出3株能稳定分泌抗猪IFN-γ单克隆抗体的杂交瘤细胞。ELISA叠加试验显示,3株单抗针对相同或邻近的PoIFN-γ抗原表位,制备的腹水中单抗间接ELISA效价为1×104。选取单抗IF-2株进行单抗的潜在应用研究,Westernblotting分析结果显示单抗IF-2株能与融合表达蛋白产生特异性反应,与pET-32a(+)标签蛋白无反应;间接免疫荧光检测(IFA)发现,在采用腺病毒表达系统表达PoIFN-γ的HEK-293细胞中散在大量特异性荧光。     

牛α-IFN及FMDV P12A3C双表达载体的构建及其在BHK-21细胞中的表达

从口蹄疫病毒Asia I/Jiangsu毒株的细胞毒中提取总RNA,通过RT-PCR方法分别获得FMDV的P12A及3C基因;同时以pMD18-T-α-IFN质粒为模板,PCR扩增得到α-IFN基因.将α-IFN基因及FMDV P12A及3C基因连接至双启动子表达载体pBudCE4.1上,构建成双效表达质粒pBudCE4.1-α-IFN-P12A3C,经电泳、PCR、双酶切和DNA测序鉴定表明双效质粒载体构建成功.用此重组质粒转染BHK-21细胞后并对其表达情况进行检测,表明该双表达质粒在BHK-21细胞中能够成功表达.以此重组质粒免疫乳鼠后12 h,按100 TCID50/O.1 mL的量进行攻毒,结果发现该质粒能够抑制病毒的增殖,对乳鼠有一定的保护作用.结果表明成功构建了牛α-IFN及FMDV P12A3C组合基因双表达载体,为进一步研究口蹄疫基因疫苗提供前期基础.