一株金黄色葡萄球菌噬菌体的分离鉴定与生物学特性

【背景】金黄色葡萄球菌作为一种条件致病菌,在临床感染中扮演着重要的角色,需要研究更多更有效的防治手段。【目的】分离金黄色葡萄球菌噬菌体,研究其生物学特性,从而为金黄色葡萄球菌的替代防治提供理论借鉴。【方法】以金黄色葡萄球菌D085为宿主从污水中分离得到一株噬菌体,命名为v B_Sau S_SAP3,用PEG8000浓缩、氯化铯密度梯度离心获得高纯度的噬菌体,1%乙酸双氧铀染色噬菌体进行电镜观察。测定噬菌体宿主谱、最佳感染复数(Multiplicity of Infection,MOI)、一步生长曲线、热稳定性、pH值稳定性及有机溶剂对噬菌体活性的影响。平衡酚法获取噬菌体基因组,Illumina测序技术和SPAdes软件进行基因组测序分析。【结果】电镜下,噬菌体SAP3头部直径为60±5 nm,尾部长170±5 nm。噬菌体vB_SauS_SAP3还能裂解5株金黄色葡萄球菌和1株产色葡萄球菌,其最佳感染复数为0.1。噬菌体vB_SauS_SAP3潜伏期为20 min,60 min后进入平台期,裂解量约为210 PFU/cell;对45°C以下温度有一定耐受性,超过45°C开始急剧失活;能在中性pH值时保持稳定活性,酸性环境会使其急剧失活,对碱性环境有一定的抵抗力;对氯仿和异戊醇不耐受。其基因组分析结果表明:噬菌体基因组大小为41950bp,GC含量为35.42%,预测有65个开放阅读框(Open Reading Frame,ORF)。进化分析表明,噬菌体vB_SauS_SAP3属于长尾科噬菌体,是一种新型的噬菌体。【结论】噬菌体vB_SauS_SAP3是一株窄谱的能够耐受一定温度和碱性环境的长尾科新型噬菌体,对其研究可为金黄色葡萄球菌噬菌体的研究提供理论材料。     

猪源冠状病毒TGEV中国分离株纤突蛋白生物信息学分析

以猪源冠状病毒(Porcine coronavirus) TGEV 纤突蛋白基因序列为基础,利用生物软件对TGEV中国分离株纤突蛋白进行N-糖基化位点、跨膜螺旋、进化树、二级结构及抗原位点的预测和分析.结果显示所有TGEV毒株可分为3个基因型,4株中国分离株分别归属于以上3个基因型,属于Ⅰ型的中国株TSX在跨膜螺旋的氨基酸及二级结构上与其他中国株有明显的差异,而同属于Ⅲ型中国毒株SC-Y和TH- 98在跨膜螺旋的氨基酸及二级结构上非常接近,而所有中国分离株抗原表位没有明显差别,表明TGEV在中国没有显著的变异.     

牛α-IFN及FMDV P12A3C双表达载体的构建及其在BHK-21细胞中的表达

从口蹄疫病毒Asia I/Jiangsu毒株的细胞毒中提取总RNA,通过RT-PCR方法分别获得FMDV的P12A及3C基因;同时以pMD18-T-α-IFN质粒为模板,PCR扩增得到α-IFN基因.将α-IFN基因及FMDV P12A及3C基因连接至双启动子表达载体pBudCE4.1上,构建成双效表达质粒pBudCE4.1-α-IFN-P12A3C,经电泳、PCR、双酶切和DNA测序鉴定表明双效质粒载体构建成功.用此重组质粒转染BHK-21细胞后并对其表达情况进行检测,表明该双表达质粒在BHK-21细胞中能够成功表达.以此重组质粒免疫乳鼠后12 h,按100 TCID50/O.1 mL的量进行攻毒,结果发现该质粒能够抑制病毒的增殖,对乳鼠有一定的保护作用.结果表明成功构建了牛α-IFN及FMDV P12A3C组合基因双表达载体,为进一步研究口蹄疫基因疫苗提供前期基础.     

猪γ-干扰素的克隆表达及单抗的潜在应用

以刀豆素A(ConA)刺激长白猪外周血单个核细胞(PBMC),提取的总RNA为模板,采用一步法RT-PCR扩增出包含猪γ-干扰素(PoIFN-γ)完整基因的片段。将完整的PoIFN-γ基因亚克隆到pET-32a(+)上,构建pET-IFN-γ融合表达载体,转化入Rosetta(DE3)后IPTG诱导表达,得到大小约为36.8kD的目的蛋白。将目的蛋白检测及纯化后免疫后BALB/c小鼠,取脾细胞与SP2/0细胞融合,最终筛选出3株能稳定分泌抗猪IFN-γ单克隆抗体的杂交瘤细胞。ELISA叠加试验显示,3株单抗针对相同或邻近的PoIFN-γ抗原表位,制备的腹水中单抗间接ELISA效价为1×104。选取单抗IF-2株进行单抗的潜在应用研究,Westernblotting分析结果显示单抗IF-2株能与融合表达蛋白产生特异性反应,与pET-32a(+)标签蛋白无反应;间接免疫荧光检测(IFA)发现,在采用腺病毒表达系统表达PoIFN-γ的HEK-293细胞中散在大量特异性荧光。