噬菌体RB69 DNA聚合酶的表达、分离纯化和其聚合反应的稳态动力学研究

噬菌体ＲＢ６９外切酶活性缺失的ＤＮＡ 聚合酶突变体（Ｄ２２２Ａ／Ｄ３２７Ａ）在大肠杆菌细胞中表达,表达量达细胞蛋白总量的６９％ ．表达后经ＤＥＡＥ－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦａｓｔＦｌｏｗ , Ｓｏｕｒｃｅ ３０Ｑ 和ＨＴＰ三步分离纯化,纯度可达９９％ 以上．随后测定了该酶利用５种ｄＮＴＰ为底物进行聚合反应的酶促动力学常数（Ｋｍ 和Ｋｃａｔ）,结果表明该酶利用ｄＵＴＰ的能力与利用ｄＴＴＰ的能力相近,Ｋｍ （ｄＴＴＰ）和Ｋｍ（ｄＵＴＰ）均较高于其它３种脱氧核苷酸的Ｋｍ （ｄＡＴＰ, ｄＣＴＰ, ｄＧＴＰ）,推测其Ｋｍ 值的差异主要来源于Ｔ／Ｕ 碱基本身,而并非全部由ＧＣ碱基配对与ＡＴ碱基配对之间的氢键作用力的强弱差别所决定．     

噬菌体RB69 DNA聚合酶以不正确的核苷酸为底物的聚合反应的稳态动力学研究

测定了ＲＢ６９ ＤＮＡ 聚合酶以不正确的核苷酸（ｒＮＴＰ、ｄｄＮＴＰ以及碱基不配对的ｄＮＴＰ）为底物进行聚合反应的稳态动力学常数,并与Ｋｌｅｎｏｗ 酶进行了比较．结果表明,ＲＢ６９ ＤＮＡ 聚合酶在以不正确的核苷酸为底物进行聚合反应时,其Ｋｍ 值与正确底物参入时相比有大幅度提高,而ｋｃａｔ保持不变或下降幅度较小．而Ｋｌｅｎｏｗ 酶在利用不正确的核苷酸为底物时,与正确底物参入时相比,其ｋｃａｔ大幅度下降,而Ｋｍ （或ＫＤ）基本保持不变或上升较小幅度．两种酶不同的动力学特点反映出它们不同的底物选择机制．     

大鼠、小鼠胰蛋白酶的分离纯化及动力学性质

采用STI-Sepharose 4B亲和层析的方法,从鼠新鲜胰脏中分离得到纯的胰蛋白酶。大鼠胰蛋白酶的比活为24 615BAEEU/mg蛋白,总活性回收率47％,小鼠胰蛋白酶的比活为32 768BAEEU/mg蛋白,总活性回收率55％。经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定,大鼠、小鼠胰蛋白酶均呈现单一蛋白带,两者的分子量都是24kD。用等电聚焦电泳测定,二者的等电点均为p19.5以上。对它们的动力学性质作了研究,大鼠胰蛋白酶的Km值为2.33×10~(-4)mol/L,K,值为0.92×10~(-5)mol/L,小鼠胰蛋白酶的Km值为5.60×10~(-4)mol/L,K:值为1.27×10~(-5)mol/L。