循环血中GM-CFC的性能研究

利用造血细胞体外琼脂培养技术,比较了狗的不同来源的GM—CFC增殖、分化性能和辐射敏感性。结果表明,在正常生理条件下循环血中GM—CFC集落产率约为骨髓的1/60;细胞集落开始形成时间较骨髓晚1天,细胞集落随培养时间(前3—5天)增加而增加,其增加速率约为骨髓的20%;辐射敏感性D_0值为0.34Gy,明显低于骨髓中GM—CFC的D_0值(0.82Gy)。造血干细胞动员剂动员后血中GM—CFC数量明显增加,细胞集落增加速率约为骨髓的59%,D_0值为0.72Gy。从而为循环血干细胞移植疗效提供了实验依据。     

质粒pcDNA3—HGF的大规模纯经制备研究

质粒ｐｃＤＮＡ３－ＨＧＦ具有潜在的临床治疗缺血性疾病的应用前景。大规模纯化制备是质粒ＤＮＡ应用于基因治疗的关键步骤。质粒大规模纯化制备流程包括：发酵、离心收集细胞、碱性裂解、Ｑ－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＸＬ捕获质粒ＤＮＡ、Ｓｏｕｒｃｅ １５Ｑ精制质粒ＤＮＡ,所得纯超螺旋质粒ｐｃＤＮＡ３－ＨＧＦ符合质量标准。该纯化制备方法避免使用动物源性的酶及有毒试剂。     

影响人骨髓CFU-C产率某些因素的分析

在CFU-C(粒系或单核-巨噬细胞集落生成单位)体外琼脂培养中,只有在CSF(细胞集落生成刺激因子)的作用下粒系祖细胞才能增殖、分化,生长成为细胞集落。CSF来源广泛,其刺激活力文献报告不一。此外,CFU-C产率波动较大,影响因素甚多。本文在相同的实验条件下,比较了不同来源的CSF刺激活力,并对影响CFU-C产率的某些因素进行了分析。     

重组腺病毒Ad-GFP的纯化

目的：用色谱法纯化制备携带绿色荧光蛋白基因的重组腺病毒。方法：采用5L生物反应器悬浮培养HEK-293N3S细胞进行病毒的扩增,冻融法裂解细胞,通过超滤、Source15Q离子交换层析和Sepharose4Fast Flow凝胶过滤层析进行分离纯化,采用分光光度法和高效液相色谱法分析重组腺病毒产品的纯度,采用组织培养半数感染剂量方法测定病毒的感染滴度。结果：通过两步色谱层析得到产品,经分光光度法分析,其D260nm/D280nm比值为1.21,高效液相色谱法分析其纯度达96.5%,产品滴度为1.0×1011U/mL,病毒颗粒数为1.76×1012/mL,比活性为5.68%。结论：确定了稳定可行的重组腺病毒色谱分离工艺,得到的产品在纯度、滴度和比活性等方面均符合国家食品药品监督管理局的标准。     

反相高效液相色谱法分析聚乙二醇修饰的水蛭素

目的：采用反相高效液相色谱法（RP-HPLC）对聚乙二醇（PEG）修饰的水蛭素进行分析分离,用以分析修饰产物中不同修饰度水蛭素的组成和比例。方法：色谱柱为Hypersil C18,5μm,4.6mm×150mm;流动相A为H2O＋0.01％的三氟乙酸,流动相B为乙腈＋0.01％的三氟乙酸。40min内由10％-50％流动相B进行梯度洗脱,洗脱流速1mL／min,上样量50μL,检测波长为214nm。结果：在单甲基化PEG-丙酸琥珀酰亚胺和水蛭素摩尔比不同的的反应产物中,PEG1-水蛭素、PEG2-水蛭素均可以达到基线分离,且不同批次的反应产物进行RP-HPLC的重复性良好。结论：RP-HPLC可以有效地对PEG修饰的水蛭素产物进行分析分离,为PEG化水蛭素的长效、缓释剂型的开发提供技术支持。     

培养基对重组质粒pcDNA3—HGF产率的影响

重组质粒ＤＮＡ用于基因治疗需要大量符合药学规格的质粒ＤＮＡ,发酵是影响质粒产率的关键步骤之一。比较了４种不同的培养基对ｐｃＤＮＡ３－ＨＧＦ产率的影响,其中自配复合培养基（ＺＰ）质粒产率最高,而ＬＢ培养基的质粒产率最低,５Ｌ发酵罐发酵最终ｐｃＤＮＡ３－ＨＧＦ产率达７２ｍｇ／Ｌ,为大规模发酵生产提供依据。     

重组质粒pUDKH工程菌库的制备及检定

目的:pUDKH是由本实验室构建的携带人肝细胞生长因子(HGF)基因的真核表达质粒,具有治疗肢体动脉闭塞病的应用潜能。为了生产制备重组质粒pUDKH,须建立菌种库并对其进行质量检定。方法:将质粒pUDKH转化大肠杆菌DH5α,经筛选后制备成初始菌种库和工作菌种库,对菌种进行革兰染色、电镜、抗生素抗性、遗传稳定性、质粒拷贝数、生化反应等检定。结果与结论:菌种生产pUDKH的产量较高,无支原体及其他微生物污染,40代次内菌种性状、遗传稳定性、质粒拷贝数均稳定,可作为工艺生产用菌种。     

抗凝蛋白EH体外活性检测条件的建立

EH蛋白是一种水蛭素衍生物,它是在水蛭素的N端引入了一小段寡肽,该寡肽可被凝血因子XIa(factor XIa,FXIa)和Xa(factor Xa,FXa)裂解释放水蛭素的抗凝血酶活性.比较在不同条件下FXa裂解EH蛋白的效果,包括裂解时间(2h,4h,6h,8h,10h,20h)、裂解温度(25℃,37℃,40℃)...     

质粒治疗肢体动脉闭塞性疾病的安全性分析

肢体动脉血管闭塞性病是一种严重危害人类健康的疾病,许多病人最终要截肢,基因治疗为这类患带来了希望。利用肝细胞生长因子促进血管生成的作用,采用质粒作为载体对大鼠和故事片诉下肢动脉闭塞疾病模型进行治疗,效果良好。为探讨基因治疗的安全性问题,用绿色荧光蛋白报告基因研究质粒在体内的分布和表达,方法简便。通过制作冰冻切片观察绿色荧光蛋白在小鼠体内的表达情况发现局部注射质粒不会造成全身性扩散,表明该方法安全。     

重组质粒pUDKH的质量分析

目的:分析研究pUDKH的质量。pUDKH是由本实验室构建的携带人肝细胞生长因子(HGF)基因的真核表达质粒,具有治疗肢体动脉闭塞病的应用潜能。方法:用光密度法分析pUDKH的浓度及纯度;用0.8%琼脂糖凝胶电泳分析超螺旋pUDKH比例及RNA;以地高辛标记的核酸探针固相斑点杂交法测定残留宿主DNA含量;用酶联免疫法测定残留宿主菌蛋白;以4组限制性内切酶分析一致性;PCR扩增目的基因片段;抑菌圈测定板测定残余抗生素;用鲎试剂检测细菌内毒素;对CHO细胞进行基因转染;ELISA检测上清HGF表达量;用Transwells法分析表达的上清液诱导ECV304细胞迁移数。结果:03批次pUDKH的浓度为1.97mg/mL,D260nm/D280nm值为1.84,超螺旋pUDKH比例为95.5%;电泳图谱中未见RNA;残留宿主DNA含量低于质粒DNA的0.2%;菌体蛋白质残留含量低于质粒DNA的0.1%;限制性酶切图谱与自行制备的对照品一致;PCR扩增到HGF基因片段,长约2.2kb;未见残余抗生素(卡那霉素)抑菌圈;细菌内毒素≤0.03125EU/mL;转染的CHO细胞上清HGF表达量为39.32ng/mL;表达的上清诱导ECV304细胞迁移数高于对照组2倍。结论:03批次pUDKH的质量符合药学规格。