毕赤酵母表达的neurturin对恒河猴帕金森氏病模型中黑质多巴胺能神经元的保护作用

帕金森氏病(PD)是由于多巴胺能神经元变性、坏死,导致黑质-纹状体系统的多巴胺含量下降而引起的一种神经系统退行性疾病,目前还没有一种很好的方法能使之治愈.Neurturin（NTN）能特异地作用于中脑多巴胺能神经元,对该类神经元具营养和保护作用.经静脉注射1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶(MPTP)诱导恒河猴产生帕金森氏病模型,并在NTN治疗组,注射MPTP之前48 h脑室内注射重组毕赤酵母表达的人NTN 1 mg. 结果表明：模型组猴均逐渐出现了PD症状,而NTN治疗组猴,PD症状比较轻或不明显;荧光分光光度法测定MPTP模型组猴黑质、壳核和尾状核多巴胺（DA）、5-羟色胺（5-HT）和5-羟吲哚乙酸（5-HIAA）的含量结果与正常对照组相比均显著降低,NTN治疗组猴的黑质、壳核和尾状核中的DA、5-HT和5-HIAA与对照组相比无显著性差异,而与模型组相比,DA、5-HT和5-HIAA含量均明显增加;光镜检查MPTP模型组猴黑质神经元细胞明显脱失,而NTN治疗组猴黑质神经元细胞丢失不明显,与正常对照组猴无差别.上述结果表明,制备的重组人NTN在恒河猴体内能保护中脑黑质多巴胺能神经元不受MPTP的损伤,使其DA含量及多巴胺能神经元维持正常,在MPTP存在下没有发生PD症状.     

戊型肝炎病毒ORF2编码多肽抗原的表达及其特性研究

迄今所发现的唯一的戊型肝炎病毒（HEV）中和表位定位于开放读码框架2（ORF2）编码蛋白的第578和第607氨基酸（aa）之间的区域。将对应此区域的基因片段通过一段柔性的甘氨酸铰链与乙型肝炎病毒（HBV）表面抗原（HBsAg）基因的3′端相连,构建成HBV/HEV融合基因。该融合基因在毕赤酵母细胞内的表达产物物为分子量约29kDa的融合蛋白,具有组装成嵌合病毒样颗粒（VLP）的能力。此嵌合VLP具有与HBsAgVLP相似的特性且保留了天然HBV/HEV双重抗原性。对此嵌合VLP特性的初步研究提示其可能具有HBV/HEV双价重组疫苗的潜在应用前景。     

huGM-CSF(9-127)-IL-6(29-184)融合蛋白的复性及纯化研究

利用Q Sepharose H.P.离子交换柱层析在8mol/L尿素变性条件下对huGM-CSF(9-127)-IL-6(29-184)融合蛋白进行初步纯化,然后再利用Sephacryl S-200分子筛柱层析复性及纯化后获得目的蛋白,其纯度达到95%以上。该纯化方案成功地解决了稀释复性或透析复性产物在进行Q Sepharose H.P.离子交换柱层析时目的蛋白不稳定而沉积于柱上的问题,获得了较好的复性效果,复性率达到80%以上。使用该纯化方案,1天内便可基本完成重组蛋白的复性及纯化过程,而且也便于扩大。     

huGM-CSF(9-127)-IL-6(29-184)融合蛋白的复性及纯化研究

利用Q Sepharose H.P.离子交换柱层析在8mol/L尿素变性条件下对huGM-CSF(9-127)-IL-6(29-184）融合蛋白进行初步纯化,然后再利用Sephacryl S-200分子筛柱层析复性及纯化后获得目的蛋白,其纯度达到95％以上。该纯化方案成功地解决了稀释复性或透析复性产物在进行Q Sepharose H.P.离子交换柱层析时目的蛋白不稳定而沉积于柱上的问题,获得了较好的复性效果,复性率达到80％以上。使用该纯化方案,1天内便可基本完成重组蛋白的复性及纯化过程,而且也便于扩大。     

啤酒酵母生产的重组水蛭素的纯化及脱色

对啤酒酵母生产的重组水蛭素变异体1(rHV1)进行多步骤的纯化。首先将分泌到培养上清液中的水蛭素进行硫酸铵沉淀和SephadexG-50凝胶过滤,再用Q-SepharoseHP阴离子交换层析分离,最后用HPLCSP-5PW阳离子交换柱脱色及HPLCC8柱反相层析。真空干燥后得到的水蛭素蛋白经SPS-PAGE、N端氨基酸序列分析、抗凝血酶活力分析鉴定,证明已获得高纯度的重组水蛭素HV1制剂,为利用基因工程方法生产重组水蛭素的规模化生产及临床应用提供了依据     

戊型肝炎病毒实验感染恒河猴的研究

报道了用戊型肝炎(Hepatitis E, HE)病人粪便悬液感染恒河猴后的组织病理学、血液生化与免疫学以及病毒学分子生物学检测的结果.三只实验猴在感染后第3～4周均出现ALT异常;粪便以及肝脏与胆囊组织超薄切片中电镜观察到27～34nm大小的病毒样颗粒;病理组织切片观察表明,肝脏组织有典型的急性炎症病灶;粪便与血清经RT-nPCR扩增到戊型肝炎病毒(Hepatitis E Virus, HEV)特异性片段,粪便排毒从感染后第7天持续至第50天左右,病毒血症迟于粪便排毒,出现于感染后两周左右,维持1～2周;ELISA检测发现,实验猴血清中HEV IgG抗体水平在感染后3～4周阳转,4～5个月后转阴.这些实验结果提示,恒河猴作为HEV感染实验动物模型是理想的,建立系统的恒河猴实验模型对探讨HEV感染发病机理、机体免疫应答以及临床诊断与疫苗研制具有重要意义.     

基于HPV16E7蛋白CTLs抗原肽的病毒样颗粒治疗性疫苗的构建

目的:构建呈递HPV16 E7 CTLs抗原表位的病毒样颗粒,并初步评价病毒样颗粒作为治疗性疫苗载体的潜能。方法:根据文献选择有效的HPV16 E7 CTLs表位,合成其正负链寡核苷酸序列,并通过退火形成双链DNA片段。将片段克隆于表达乙肝核心抗原的重组质粒p Thio His AHBc Ag,使抗原肽得以呈现于病毒样颗粒。重组菌经IPTG诱导后经SDS-PAGE鉴定目的蛋白表达。菌体破碎后经硫酸铵盐析法和蔗糖密度梯度离心进行纯化,并经高效液相凝胶过滤色谱和电镜鉴定病毒样颗粒的存在。制备的病毒样颗粒免疫接种了TC-1细胞的肿瘤模型小鼠,检测小鼠肿瘤大小。此外,在体外以抗原肽刺激脾细胞,以ELISA检测IFN-γ表达水平。结果:构建的三个重组表达质粒经酶切鉴定及测序分析证实构建正确。表达的重组蛋白大小与预期相符,并形成了病毒样颗粒。免疫小鼠后显示了抑制肿瘤增长的一定作用趋势。此外,抗原肽体外刺激促进了疫苗免疫小鼠脾细胞IFN-γ的表达,显示疫苗引起机体产生E7特异性的细胞免疫应答。结论:HBc Ag VLPs是有潜能的治疗性疫苗载体。     

利用不同碳源进行毕赤酵母高密度发酵及TEF-1启动子指导下的HPV16_L1蛋白表达

目的:研究不同碳源对于毕赤酵母菌株在发酵罐中高密度生长,以及对组成型翻译延伸因子-1(TEF-1)启动子指导下HPV16_L1蛋白表达的影响。方法:利用1.5L发酵罐使用不同碳源进行毕赤酵母的高密度发酵,检测在不同碳源利用情况下菌体的增殖动力学,并以Western blot动态分析HPV16_L1蛋白的表达水平。结果:以甘油作为碳源,菌体细胞湿重可达到510g/L(OD600为189.4),HPV16_L1的表达在72h之前保持高水平;在甲醇和葡萄糖中菌体细胞湿重都可达到220g/L左右(OD600分别为75.3和77.3),甲醇利用下HPV L1蛋白在144h后仍保持较高水平表达,葡萄糖中60h HPV L1表达开始显著下降;在山梨醇作为碳源情况下菌体未能在发酵罐中获得高密度生长;总体上,甘油作为碳源在72h左右可获得最高的目的蛋白收获总量。结论:为实现毕赤酵母高密度生长与异源基因在TEF-1启动子指导下高效表达,以及HPV L1蛋白的简易、有效制备提供了基础。     

人CNTF突变体(CNTFM)基因的克隆、表达和产物纯化及活性鉴定

采用PCR的方法对睫状神经营养因子(CNTF)基因进行改造,获得CNTF突变体基因(CNTFM) ,将CNTFM基因克隆入表达载体pBV2 2 0 ,在大肠杆菌BL 2 1(Gold)中进行了表达.目的蛋白占细胞总蛋白5 5 %左右,以包涵体形式存在,经Superdex 75凝胶过滤柱一步纯化和复性,获得纯度达90 %目的蛋白.纯化的重组CNTFM蛋白能促进培养的鸡胚背根神经节长出神经突起,能明显减轻实验小鼠的体重,表明CNTFM具有良好的体内、体外生物学活性,为开发新型高效的减肥药奠定了基础.     

乙肝核心抗原病毒样颗粒呈现HPV 16L1抗原表位及特异抗体诱导

目的:构建呈现HPV 16L1抗原表位的病毒样颗粒(VLPs),为新型HPV疫苗及特异抗体制备提供新的思路。方法:将编码HPV 16L1抗原表位QPLGVGISGHPLLNKLDDTE寡聚核苷酸片段克隆于HBc Ag基因编码第78、79位氨基酸序列之间,重组质粒转化大肠杆菌DH5α。重组蛋白经IPTG诱导后以SDS-PAGE分析表达情况,并以Western blot鉴定重组蛋白中HPV 16L1表位的免疫反应性。菌体超声破碎后经硫酸铵盐析法和蔗糖密度梯度离心进行纯化,并经凝胶层析Sepharose G25脱盐,最后以电子显微镜及高效液相(HPLC)凝胶过滤色谱鉴定VLPs的存在并分析纯度。纯化的病毒样颗粒分别于0周、2周、4周经皮下注射免疫BALB/c小鼠,以Western blot分析血清特异识别L1蛋白的能力。结果:HBc Ag/L1肽嵌合蛋白获得成功表达,能够被商业化L1抗体特异识别,经密度梯度超速离心及HPLC分析显示其与HBc Ag行为一致,电子显微镜观察进一步确定其以HBc Ag病毒样颗粒形式存在。VLPs免疫小鼠获得的抗血清能够特异识别酵母表达的重组L1蛋白。结论:HBc Ag VLPs成功呈现HPV16L1蛋白并有效激发特异抗体应答。