戊型肝炎病毒实验感染恒河猴的研究

报道了用戊型肝炎（ＨｅｐａｔｉｔｉｓＥ,ＨＥ）病人粪便悬液感染恒河猴后的组织病理学、血液生化与免疫学以及病毒学分子生物学检测的结果。三只实验猴在感染后第３～４周均出现ＡＬＴ异常;粪便以及肝脏与胆囊组织超薄切片中电镜观察到２７～３４ｎｍ大小的病毒样颗粒;病理组织切片观察表明,肝脏组织有典型的急性炎症病灶;粪便与血清经ＲＴｎＰＣＲ扩增到戊型肝炎病毒（ＨｅｐａｔｉｔｉｓＥＶｉｒｕｓ,ＨＥＶ）特异性片段,粪便排毒从感染后第７天持续至第５０天左右,病毒血症迟于粪便排毒,出现于感染后两周左右,维持１～２周;ＥＬＩＳＡ检测发现,实验猴血清中ＨＥＶＩｇＧ抗体水平在感染后３～４周阳转,４～５个月后转阴。这些实验结果提示,恒河猴作为ＨＥＶ感染实验动物模型是理想的,建立系统的恒河猴实验模型对探讨ＨＥＶ感染发病机理、机体免疫应答以及临床诊断与疫苗研制具有重要意义。     

大肠杆菌表达的戊型肝炎病毒ORF2多肽对恒河猴的免疫保护研究

在大肠杆菌中表达的一段戊型肝炎病毒（HEV）结构蛋白NE2,纯化后以弗氏佐剂,按0d,10d,30d的方案10μg/针的剂量免疫3只恒河猴,在第2周抗体阳转,第6周时1只滴度达1∶100 000,另2只滴度1∶20 000,此时以106 PCR滴度的HEV病毒粪悬液攻击。对照组3只均出现血清转氨酶（ALT）升高,抗体阳转,粪便持续排毒1月以上;疫苗组无一发病,未检出非疫苗来源的抗体,其中1只始终未检出粪便排毒,另2只仅出现短暂排毒。以一份NE2免疫后猴血清（滴度1∶20 000）与103 PCR滴度的病毒混匀后感染2只恒河猴,结果对照组2只均持续排毒3周以上,抗体阳转,1只ALT明显升高;而抗体中和组2只猴始终未检出粪便排毒,抗NE2抗体缓慢下降,ALT正常。这些结果表明NE2具有良好的免疫原性和免疫保护性,有可能成为有效的戊肝疫苗。     

戊型肝炎病毒长爪沙鼠感染模型的初步研究

旨在探索应用长爪沙鼠(Meiiones unguiculataus)构建戊型肝炎病毒(hepatitis E virus,HEV)动物模型的可行性,从猪粪便稀释悬液中提取HEV RNA并鉴定,经腹腔和口服接种HEV于长爪沙鼠,并每周采集血液、相关器官(心、肝、脾、肺、肾、肠系膜淋巴结、脾脏)及粪便。用反转录PCR(RT-PCR)和免疫组化等检测方法分析各个样品。结果表明,感染后第7天开始,可从血液、肾脏、脾脏、肠系膜淋巴结、肝脏、肺、粪便中检测到HEV RNA;通过免疫组化和组织病理学观察,发现HEV可在肝脏中进行表达,并且能引起肝组织病理变化,但感染HEV后长爪沙鼠均缺乏较明显的临床表现症状。结果提示,长爪沙鼠对HEV具有易感性,感染后肝脏出现小叶性肝炎的病理变化,具有作为HEV感染动物模型的潜在价值。     

肠道传播非甲非乙肝炎在恒河猴中的传代研究

用ET-NANBH感染的两只猴(R5和R6)含病毒颗粒的粪便悬液和肝组织悬液分别接种7只和4只恒河猴,分别有5只猴和4只猴在攻毒后20—49天内ALT开始升高,持续时间为7—10天,肝组织学的特征性改变为肝细胞的嗜酸性变和嗜酸小体的形成。在猴ALT升高前2—3天和升高后一周内均检查到大量的27—34nm的病毒样颗粒,这些颗粒只与ET-NANBH病人血清、黑猩猩和猴感染后急性期和恢复期血清发生特异性聚集。在猴感染后血清中未检出抗-HAV、抗-HAV-IgM、HBsAg和抗-HBe-IgM。结果提示:恒河猴是研究ET-NANBH较适宜的动物模型;病人和猴粪便中的27—34nm的病毒样颗粒是ET-NANBH的病原因子。     

大肠杆菌重组颗粒性戊型肝炎疫苗对恒河猴的免疫保护

大肠杆菌表达的戊型肝炎病毒(HEV)衣壳蛋白ORF2片段HEV 239重组蛋白颗粒,经铝佐剂吸附后,分别以5μg、10μg和20μg剂量免疫恒河猴,28天时以相同剂量加强免疫1次,3周后分别以不同病毒滴度的基因Ⅰ型或基因Ⅳ型HEV静脉攻击.结果,加强后3周,3个免疫剂量组猴的抗体几何平均滴度分别为1∶27175、1∶34409、1∶41607,以世界卫生组织参比血清定量,则分别为1098IU/ml,1357IU/ml、1724IU/ml.每个剂量免疫组及对照组各有3只猴接受107病毒滴度基因Ⅰ型HEV感染,对照组3只猴均被成功感染,2只出现肝炎;20μg免疫组3只猴均未被感染;10μg和5μg免疫组各有2只猴未被感染,另1只猴出现短暂感染,免疫猴均未出现肝炎.3个剂量免疫组及对照组另外3只猴,接受104病毒滴度基因Ⅰ型HEV感染,对照组3只猴均被感染,1只出现肝炎;而免疫猴均未被感染,也未出现肝炎.3只10μg免疫猴和3只对照猴分别接受107病毒滴度基因Ⅳ型HEV感染,对照组均被感染并出现肝炎,而免疫组均未出现肝炎,有2只未被感染,另1只被短暂感染.另有3只10μg免疫猴和3只对照猴分别接受104病毒滴度基因Ⅳ型HEV感染,对照组均被感染,而免疫组均未被感染.这些结果表明:HEV239疫苗可以完全预防HEV导致的肝炎,并保护大多数恒河猴不被HEV感染.另外,疫苗对基因Ⅳ型HEV的保护性与基因Ⅰ型HEV相近.     

SARS冠状病毒感染恒河猴的病毒、血清学检测研究

[目的]对感染SARS-CoV的恒河猴进行病毒、血清学等指标检测及研究,确定模型动物成功感染,并为SARS发病机制,疫苗评价,药物筛选确定参考指标。[方法]SARSCo-V经鼻腔接种8只恒河猴,在感染的第1天开始到5、7、10、15、20、30和60天分别安乐死时,不同时间取咽拭子、血液和脏器,进行病毒分离,RT-PCR检测和抗体测定。[结果]用巢式RT-PCR在感染后每天提取的咽拭子标本中检测SARS-CoV的RNA,以细胞培养冠状病毒为阳性对照,以正常恒河猴咽拭子为阴性对照,在8只动物病毒接种第5天开始可检测到大小为797bp的目的条带,阳性检出最长可持续到第15天。进一步用病毒分离实验对PCR结果进行确证,8只动物中的5只恒河猴接种5天的咽拭子标本中,经Vero细胞培养,细胞产生了典型细胞病变(CPE),提示SARS冠状病毒能感染恒河猴并有病毒的复制和排毒。IFA方法证实为SRAS-CoV抗原存在。SARS-CoV感染恒河猴后,可以检测出免疫反应。在SARS冠状病毒接种前和接种后第5、8、11、15、19、23、26、30、34、每隔4-7天以及安乐死时采血,制备血清测定抗体,8只恒河猴接种病毒前均血清中SARS冠状病毒特异性抗体IgG为阴性,10天后安乐处死的5只感染猴在11-15天开始,至安乐死时,均为阳性。IgG阳性的5只恒河猴均有一定的中和抗体产生,且对SARS病毒感染细胞有一定的保护性。感染SARS病毒猴后与正常猴比较,其细胞杀伤效应明显增强。感染SARS-CoV的恒河猴不仅出现与SARS患者类似的临床和病理学改变,也在一定时期内排毒,出现特异免疫反应,这些指标均可作为药物筛选、疫苗评价等方面的重要参数。     

戊型肝炎治疗的进展

戊型肝炎(Hepatitis E,HE)是常见的急性病毒性肝炎之一,它由戊型肝炎病毒(Hepatitis E virus,HEV)感染引起。患者以中青年以及老年人居多,老年人、孕妇和肝脏疾病患者若感染HEV可能引发重症肝炎且病死率高。孕妇感染戊型肝炎病毒后,病死率可高达20%-30%[1,2]。戊型肝炎呈全球性分布,以散发多见,流行主要发生在亚洲、非洲和中美洲的发展中国家。1986-1988年新疆南部地区发生的戊型肝炎水型流行是迄今世界上最大一次流行,共计发病119 280例,死亡707例[3]。近些年来包括美国、日本、中国和印度等在内的一些发达及发展中国家或地区,戊型肝炎发病率有逐渐上升趋势,重型肝炎发病率和病死率逐年增加。控制该病已刻不容缓,但目前临床上还没有戊型肝炎标准化的治疗方案,本文针对戊型肝炎治疗方面进行介绍。     

器官移植病人戊型肝炎病毒慢性化感染及治疗

戊型肝炎是由戊型肝炎病毒(Hepatitis E virus,HEV)感染引起的急性病毒性肝炎,其发病率居急性病毒性肝炎之首。戊型肝炎通常呈急性感染病程,2008年以来陆续发现器官移植病人等免疫抑制患者感染HEV后可能迁延为慢性化。在无抗病毒药物治疗的情况下,器官移植病人感染HEV后迁延为慢性感染的比例超过60%,其中10%的病人慢性感染HEV后可能出现肝纤维化,并且在较短的时间内进展为失代偿性肝硬化导致死亡。本文简要综述器官移植病人HEV慢性化感染及治疗。     

细胞分离戊型肝炎病毒的初步研究

本文报告用2BS细胞分离戊型肝炎病毒(HEV)感染成功的猴肝脏标本中的HEV的初步结果,将2BS细胞长成致密单层,接种已知含有HEV的肝悬液,盲传至第4代,发现在第27天细胞出现了轻微的细胞病变(CPE),随着进一步的传代,细胞病变时间逐渐提前。至第7代时,在第17天就可见到CPE,CPE的主要特征是细胞间隙变宽,透明度降低和轻度细胞破坏,无大片细胞溶解和脱落现象。免疫电镜检查在第5代和第6代细胞培养液中见到很少的27—34nm的病毒颗粒。将第4代至第7代的细胞悬液20ml接种了3只恒河猴,有2只猴在24天和26天出现了典型的ALT升高,待这3只猴恢复正常后一年,再次接种以上细胞悬液20ml,3只猴全部发生了ALT升高,并在胆汁中检查到27—34nm的病毒颗粒,我们初步推测2BS适应的这株病毒很可能是戊型肝炎病毒。     

SARS-CoV中和抗体保护恒河猴等感染SARS-CoV研究

[目的]阐明SARS病毒感染后能否再次感染,疫苗产生的抗体中长期保护效果,被动免疫是否真正安全有效等,为防治SARS提供实验依据。[方法]实验分4组,分别为一组(SARS恒河猴恢复组):用感染SARS-CoV发病12月后的4只恒河猴,均有中和抗体产生。二组(SARS食蟹猴恢复组):用感染SARS-CoV发病12月后的3只食蟹猴,均有中和抗体产生。三组(SARS血清输入恒河猴组):3只恒河猴,病毒接种时中和抗体阴性。病毒接种两天后输入抗体阳性血清(恒河猴血清,感染获得,效价为:1:128),用量10ml/只,分别经肌肉和静脉输入,各5ml。四组(恒河猴SARS-CoV感染组):2只恒河猴,病毒接种时中和抗体阴性。SARSCo-V经鼻腔接种,在感染的第1天开始到7天安乐死时,不同时间取咽拭子、血液和脏器,进行病毒分离,RT-PCR检测和中和抗体测定。[结果]一组(SARS恒河猴恢复组):接种SARS-CoV后未见发热等异常临床表现。血清生化无ALT、LDH、CK、总蛋白和血清白蛋白异常。3只猴在接种病毒后的咽拭子中,RT-PCR分别未检出、第1天检出、第1-3天中检出病毒。第2、5、7天咽拭子中、7天安乐死时血、肺、肝、脾和淋巴结等组织中病毒分离均为阴性。2只猴肺组织病理学检查见轻度肺炎。二组(SARS食蟹猴恢复组):接种3只未见任何不良临床表现,血清生化5项正常。3只猴在接种病毒后的咽拭子标本中,RT-PCR分别未检出SARS病毒、在第1-2天检出、在第1-3天中检出病毒。第2、5、7天咽拭子中、7天安乐死时血、肺、肝、脾和淋巴结等组织中病毒分离均为阴性。3只猴肺组织病理学检查见轻度肺炎等。三组(SARS血清输入恒河猴组):3只恒河猴在病毒接种的第2-5天时有一过性的体温升高,3940℃。血清生化5项正常。3只猴在接种病毒后的咽拭子标本中,RT-PCR分别在第1-3、第1-4天和第1-2天检出SARS病毒。2只猴第7天咽拭子中病毒分离阳性。另外1只在第2、5、7天咽拭子中、7天安乐死时血、肺、肝、脾和淋巴结等组织中病毒分离均为阴性。3只猴肺组织病理学检查见轻度肺炎等。四组(SARS恒河猴SARS-CoV感染组):2只猴病毒接种后,第2-4天时有一过性的体温升高,3940℃。2只进行接种病毒后1-7天安乐死时,RT-PCR在恒河猴的咽拭子标本中连续检出SARS病毒。在第2、5天咽拭子中、7天安乐死时肺组织中病毒分离阳性。2只猴肺等组织病理学检查发现肺组织表面局部有轻度发灰实变现象,可见到间质性肺炎病变,内皮细胞受损,出血和水肿。大多数肺泡没有完整的内衬细胞残留,肺泡间隔变宽并被以吞噬细胞为主的单核炎症细胞浸润,同SARS肺炎改变。实验表明,前期感染产生中和抗体的恒河猴、食蟹猴再次感染病毒,和模型对照猴比较,动物肺组织等只出现轻微或无病理变化,RT-PCR检出时间大大缩短,病毒培养未能分离出病毒,所有这些指标,均证实中和抗体有明显的保护作用,是有效的。被动免疫从结果来看,有一定的作用,但保护作用弱。