中华蜜蜂和意大利蜜蜂感染囊状幼虫病毒后免疫及发育相关基因表达比较

【目的】本文旨在探究囊状幼虫病毒(sacbrood virus, SBV)对中华蜜蜂(Apis cerana cerana,简称中蜂)和意大利蜜蜂(Apis mellifera ligustica,简称意蜂)工蜂幼虫发育和免疫基因、营养代谢基因、抗病毒基因、细胞发育及代谢相关基因表达的影响。【方法】从蜂群中移取2日龄的中蜂和意蜂幼虫,在培养箱(34℃, RH 85%)进行人工饲养,3日龄时接种SBV病毒,每天观察记录死亡情况,并通过实时定量PCR (real-time quantitative polymerase chain reaction, RT-qPCR)检测4日龄和7日龄幼虫体内SBV基因相对表达量,及免疫基因(Apidaecin、Abaecin、Hymenoptaecin、Denfensin、Lys-1、Pgrp-lc、Kenny、Domeless)、营养代谢基因(Ilp1、Hex110、Vg)、抗病毒基因(Dis3、Dicer、Ago1)、细胞组成及发育调控基因(Vhdl、Co-1-iv)以及细胞代谢和调控基因(Mta1)的表达水平。【结果】通过分析比较发现,感染相同剂量...     

基于中肠代谢组学意大利蜜蜂工蜂枣花病的发病机理研究

【目的】利用代谢组学分析患枣花病意大利蜜蜂Apis mellifera ligustica工蜂中肠内代谢物变化,挖掘出与蜜蜂枣花病相关的重要代谢通路,旨在揭示蜜蜂枣花病发病机制,为枣花病靶向药物的研发提供理论依据。【方法】分别利用液相色谱-质谱联用(liquid chromatography-mass spectrometry, LC-MS)和气相色谱-质谱联用(gas chromatography-mass spectrometry, GC-MS)技术对患枣花病和健康意大利蜜蜂工蜂进行中肠非靶向代谢组检测;通过主成分分析(principal component analysis, PCA)和正交偏最小二乘法判别分析(orthogonal partial least squares discriminant analysis, OPLS-DA),以变量投影重要性(variable projection importance, VIP)>1.0,差异倍数(fold change, FC)>2.0和P<0.05为标准筛选差异代谢物,并对其进行KEGG注释和通路富集;利用生...     

参与调控意大利蜜蜂工蜂中肠基因表达的东方蜜蜂微孢子虫miRNA的组学解析及其调控网络

【目的】本研究结合前期已获得的miRNA和mRNA组学数据对东方蜜蜂微孢子虫Nosema ceranae的差异表达miRNA(differentially expressed miRNA, DEmiRNA)靶向意大利蜜蜂Apis mellifera ligustica工蜂中肠的mRNA和差异表达mRNA(differentially expressed mRNA, DEmRNA)进行生物信息学预测、数据库注释和调控网络分析,旨在解析东方蜜蜂微孢子虫对意大利蜜蜂工蜂中肠的基因表达调控。【方法】比较东方蜜蜂微孢子虫感染7 d(AmT1)和10 d(AmT2)的意大利蜜蜂工蜂中肠和未感染中肠(分别为AmCK1和AmCK2)的mRNA数据,筛选意大利蜜蜂工蜂的显著性DEmRNA;通过比较侵染AmT1和AmT2的东方蜜蜂微孢子虫(分别为NcT1和NcT2)和东方蜜蜂微孢子虫纯净孢子(NcCK)的miRNA数据筛选出东方蜜蜂微孢子虫的DEmiRNA。利用TargetFinder软件预测东方蜜蜂微孢子虫DEmiRNA靶向的意大利蜜蜂工蜂中肠DEmRNA。利用相关生物信息学工具对上述意大利蜜蜂工蜂中肠靶DEmRNA进行GO和KEGG数据库注释。根据KEGG数据库注释信息筛选出意大利蜜蜂工蜂中肠免疫防御和能量代谢通路相关DEmRNA,并构建和分析上述DEmRNA与相应的东方蜜蜂微孢子虫DEmiRNA之间的调控网络。【结果】NcCK vs NcT1比较组中东方蜜蜂微孢子虫的77条显著上调miRNA和52条显著下调miRNA可分别靶向AmCK1 vs AmT1比较组中意大利蜜蜂工蜂中肠的118条显著下调mRNA和135条显著上调mRNA,这些mRNA可分别注释到31和25个GO条目,以及113和107条KEGG通路。NcCK vs NcT2比较组中东方蜜蜂微孢子虫的52条显著上调miRNA和49条显著下调miRNA可分别靶向AmCK2 vs AmT2比较组中意大利蜜蜂工蜂中肠的97条显著下调mRNA和210条显著上调mRNA,这些mRNA可分别注释到27和30个GO条目以及97和127条KEGG通路。NcCK vs NcT1和NcCK vs NcT2比较组中的11条共同显著上调miRNA和19条共同显著下调miRNA分别靶向AmCK1 vs AmT1和AmCK2 vs AmT2比较组的6条共同显著下调和14条共同显著上调mRNA,可分别注释到7和10个GO条目以及0和9条KEGG通路。NcCK vs NcT1和NcCK vs NcT2比较组中东方蜜蜂微孢子虫的DEmiRNA可靶向AmCK1 vs AmT1和AmCK2 vs AmT2比较组中意大利蜜蜂工蜂中肠的氧化磷酸化和硫代谢等能量代谢通路相关DEmRNA,以及胞吞作用、黑色素生成、溶酶体、自噬、Toll样受体信号通路、细胞凋亡、Ras信号通路、泛素介导的蛋白水解和MAPK信号通路等免疫防御通路相关DEmRNA。进一步分析发现,miR-216-x, miR-5119-y, bantam-y和miR-8-y在NcCK vs NcT1和NcCK vs NcT2比较组中皆显著上调表达,且靶向意大利蜜蜂工蜂中肠的溶酶体、黑色素生成、泛素介导的蛋白水解、MAPK信号通路及Ras信号通路等免疫防御通路相关的显著下调mRNA。【结论】在侵染过程中,东方蜜蜂微孢子虫的DEmiRNA对意大利蜜蜂工蜂的基因表达具有广泛的潜在影响,东方蜜蜂微孢子虫可能通过上调部分miRNA跨界调控意大利蜜蜂工蜂的免疫防御以促进侵染,通过下调部分miRNA跨界调控意大利蜜蜂工蜂的能量代谢以加强能量窃取并促进增殖。     

亚致死剂量吡虫啉胁迫对意大利蜜蜂工蜂嗅觉学习行为的影响及其脑部转录组分析

【目的】分析吡虫啉处理对意大利蜜蜂Apis mellifera ligustica嗅觉学习行为及脑部基因转录的影响,为新烟碱类杀虫剂对蜜蜂的负面影响提供依据。【方法】实验室条件下一次性饲喂意大利蜜蜂成年工蜂含有4 ng吡虫啉的50%蔗糖溶液,以饲喂不含吡虫啉的50%蔗糖溶液为对照,通过伸吻反应(proboscis extension response, PER)行为实验测定其对意大利蜜蜂成年工蜂嗅觉学习行为的影响;收集上述测试的意大利蜜蜂工蜂脑部提取RNA,进行RNA-Seq测序和生物信息学分析,利用实时荧光定量PCR挑选6个差异表达基因(DEGs)检测其在脑部的表达量以验证RNA-Seq测序结果。【结果】一次性饲喂意大利蜜蜂成年工蜂含4 ng吡虫啉的50%蔗糖溶液后,意大利蜜蜂的嗅觉学习能力与对照组(饲喂50%蔗糖溶液)相比显著降低。RNA-Seq测序结果显示饲喂意大利蜜蜂含4 ng吡虫啉蔗糖溶液后,处理组与对照组之间共有123个DEGs［校正后的P值(padj)<0.05)］,包括82个下调DEGs和41个上调DEGs。GO聚类分析发现下调DEGs主要富集在S-腺苷甲硫氨酸依赖性甲基转移酶活性、酸性磷酸酶活性、氧化还原酶活性、蛋白质异二聚化活性等,上调DEGs主要富集在跨膜受体活性、分子传感器活性、神经学系统过程等功能条目。KEGG富集分析显示下调DEGs主要富集在核糖体和溶酶体等细胞器、碳代谢和色氨酸代谢等代谢通路及Toll和Imd信号通路,上调DEGs未富集在KEGG代谢通路。荧光定量PCR结果显示测试的6个DEGs相对表达量变化趋势与RNA-Seq测序结果FPKM(fragments per kilobase million)值变化趋势一致,证明RNA-Seq测序结果可靠。【结论】亚致死剂量吡虫啉胁迫意大利蜜蜂成年工蜂显著降低意大利蜜蜂的嗅觉学习能力,影响意大利蜜蜂脑部免疫解毒等相关基因的表达和酶活性及氧化还原等生物代谢过程;亚致死剂量吡虫啉短时胁迫会刺激意大利蜜蜂的嗅觉感觉过程及神经信号传导过程。     

狄斯瓦螨和蜜蜂病毒对意大利蜜蜂蜂群越冬的影响

越冬期是蜂群损失最主要的阶段.通过比较分析45个意大利蜜蜂Apis mellifera ligustica蜂群在繁殖越冬蜂前的狄斯瓦螨Varroa destructor寄生率和病毒感染情况、越冬表现及越冬期存活蜂群的病毒感染情况等,探究与越冬期蜜蜂健康紧密相关的影响因素.结果表明,繁殖越冬蜂前蜂群的狄斯瓦螨寄生率与蜜蜂残翅病毒(DWV)和以色列急性麻痹病毒(IAPV)基因组拷贝数呈中等线性相关关系(pDWV=0.003,pIAPV=0.001),且狄斯瓦螨寄生率低于9％的蜂群与DWV感染程度相关性更高,而寄生率高于9％的蜂群与IAPV的相关性更高.越冬期死亡蜂群在繁殖越冬蜂前的狄斯瓦螨寄生率和IAPV病毒基因组拷贝数均显著高于存活蜂群.狄斯瓦螨和IAPV是本次实验中意蜂蜂群越冬期健康的首要影响因素.结合狄斯瓦螨寄生率和IAPV基因组拷贝数的正相关性,本研究认为在繁殖越冬蜂前将蜂螨寄生率控制在较低水平(9％以下)能有效减少越冬期意蜂蜂群损失.     

基于Illumina HiSeq测序技术研究吡虫啉对意大利蜜蜂雄蜂的影响

[目的]雄蜂对蜂群繁衍有着非常重要的作用.本研究旨在探究吡虫啉对意大利蜜蜂Apis mellifera Ligustica雄蜂生长发育和基因表达产生的影响.[方法]以意大利蜜蜂雄蜂为研究对象,分别以0.00001、0.0001和0.001 μg/μL浓度的吡虫啉对雄蜂幼虫进行连续饲喂处理.每天观察并记录幼虫的发育形态及死亡率,在雄蜂幼虫后期(移虫后6d)测量幼虫体重.利用Illumina HiSeq测序技术对经吡虫啉处理的雄蜂进行转录组测序,进而对差异表达基因进行深入分析.[结果]取食吡虫啉后的雄蜂幼虫,体重低于正常雄蜂,当浓度高于0.0001μg/μL时差异显著;雄蜂幼虫取食吡虫啉后出现死亡现象,且死亡率随吡虫啉浓度的升高而增大;差异表达基因分析结果上调与下调基因数量分别为390个和130个.GO富集分析结果上调基因共分布于55个GO条目,富集基因数量最多的是细胞进程、细胞、细胞组件、细胞膜、细胞膜组件、结合,下调基因共分布于48个GO条目,富集基因数量最多的是细胞进程、细胞、细胞组件.富集在有关生殖功能的差异表达基因中,上调基因数量为21个,下调基因数量为5个.KEGG代谢通路富集分析结果上调基因富集在159个通路上,其中富集基因数最多的是蛋白质消化吸收和神经活性配体-受体相互作用通路.下调基因富集在71个通路上,其中富集基因数最多的是溶酶体、胰液分泌、神经活性配体-受体相互作用通路.[结论]吡虫啉能抑制意大利蜜蜂雄蜂的生长发育,甚至造成幼虫死亡,同时,可以影响雄蜂的神经系统、代谢系统和生殖系统等.本研究结果为蜜蜂资源保护提供理论依据.     

噻虫嗪对意大利蜜蜂6种CYP6AS基因表达的影响

细胞色素P450单氧酶(cytochrome P450 monooxygenase,CYP)是昆虫体内重要的解毒酶。CYP6AS亚家族基因特异性的存在于膜翅目昆虫中,一些特异性的CYP6AS基因已经被证实参与到蜜蜂对某些外源物质和杀虫剂的解毒和代谢过程中。本研究主要探测了亚致死浓度噻虫嗪对意大利蜜蜂Apis mellifera ligustica CYP单氧酶活性及CYP6AS亚家族基因表达水平的影响。首先测定了噻虫嗪LC_(10)和LC_5经口处理4日龄意大利蜜蜂后48 h CYP酶活性,然后应用荧光定量PCR技术检测了6种CYP6AS基因(CYP6AS3,CYP6AS4,CYP6AS5,CYP6AS10,CYP6AS14和CYP6AS15)表达变化情况。结果表明,噻虫嗪LC_(10)和LC_5处理后,意大利蜜蜂CYP酶活性均极显著增加(P0.01)。噻虫嗪LC_(10)和LC_5处理对意大利蜜蜂CYP6AS4,CYP6AS10和CYP6AS15基因表达没有显著影响;LC_(10)和LC_5处理后CYP6AS3基因表达量显著增加(P0.05); LC_(10)处理能够显著诱导CYP6AS5基因上调表达(P0.05);而LC_(10)和LC_5处理极显著抑制CYP6AS14基因的表达(P0.01)。这为进一步探究蜜蜂对噻虫嗪的解毒机制提供了新的线索。     

不同行为表现的蜜蜂脑部多巴胺及其受体基因的检测分析

【目的】对不同行为表现的意大利蜜蜂Apis mellifera ligustica工蜂脑部多巴胺及其受体基因进行检测。【方法】从蜜蜂观察箱中采集不同行为表现的工蜂,解剖其脑部,用高效液相色谱-电化学检测器和实时荧光PCR仪分别检测多巴胺含量和受体基因相对表达量,并进行计算分析研究。【结果】建立了不同行为表现的蜜蜂脑部多巴胺及受体基因的研究方法。意大利蜜蜂哺育蜂脑部的多巴胺含量与新出房工蜂、采集蜂、休息状态下的工蜂存在显著差异。多巴胺受体1基因及多巴胺转运体基因在哺育蜂脑部处于高表达状态,4种不同分工的意大利蜜蜂脑部多巴胺受体2基因、受体3基因相对表达量差异不显著。【结论】多巴胺与蜜蜂不同行为表现密切相关,多巴胺受体1基因与转运体基因可能参与蜜蜂哺育行为。     

意大利蜜蜂工蜂幼虫肠道中ame-miR-bantam对靶基因USP和P300的表达调控

【目的】本研究旨在通过饲喂法对意大利蜜蜂Apis mellifera ligustica工蜂幼虫肠道中ame-miR-bantam进行过表达与敲减,明确ame-miR-bantam对靶基因USP和P300表达的调控作用。【方法】通过饲喂ame-miR-bantam模拟物(mimic-ame-miR-bantam)和抑制物(inhibitor-ame-miR-bantam)及相应的阴性对照mimic-NC-ame-miR-bantam和inhibitor-NC-ame-miR-bantam,对意大利蜜蜂工蜂4-6日龄幼虫肠道组织中的ame-miR-bantam分别进行过表达和敲减。利用生物信息学软件进行ame-miR-bantam的靶向预测及分析。通过RT-qPCR检测4-6日龄意大利蜜蜂工蜂幼虫肠道中ame-miR-bantam的过表达和敲减效果及靶基因USP和P300的相对表达量。【结果】相较于饲喂mimic-NC-ame-miR-bantam,饲喂mimic-ame-miR-bantam后,ame-miR-bantam在意大利蜜蜂4-6日龄工蜂幼虫肠道中均显著上调;相较于饲喂inhibitor-NC-ame-miR-bantam,饲喂inhibitor-ame-miR-bantam后,ame-miR-bantam在4日龄工蜂幼虫肠道中显著下调,在5日龄和6日龄工蜂幼虫肠道中下调表达。ame-miR-bantam共靶向222个基因,可注释到细胞进程等35个GO条目和Wnt信号通路等160条KEGG通路。相比于饲喂mimic-NC-ame-miR-bantam的阴性对照组,过表达ame-miR-bantam后,4日龄工蜂幼虫肠道中USP和P300的表达量均为上调;5日龄工蜂幼虫肠道中USP的表达量下调,P300显著下调表达;6日龄工蜂幼虫肠道中USP和P300均显著下调表达。相比于饲喂inhibitor-NC-ame-miR-bantam的阴性对照组,敲减ame-miR-bantam后,4和5日龄工蜂幼虫肠道中USP和P300的表达量均为上调;6日龄工蜂幼虫肠道中USP显著上调表达,P300的表达量上调。【结论】通过饲喂模拟物和抑制物能够分别实现意大利蜜蜂工蜂幼虫肠道中ame-miR-bantam的有效过表达和敲减;幼虫肠道中ame-miR-bantam可负调控USP和P300的表达。     

ame-miR-79负调控意大利蜜蜂工蜂幼虫肠道中靶基因CYP450和FG的表达

【目的】本研究旨在通过饲喂ame-miR-79的模拟物(mimic)和抑制物(inhibitor)对意大利蜜蜂Apis mellifera ligustica工蜂幼虫肠道内的ame-miR-79分别进行过表达和敲减,探究ame-miR-79对幼虫肠道内靶基因表达的调控作用。【方法】通过分子克隆与Sanger测序验证意大利蜜蜂工蜂幼虫肠道内ame-miR-79的序列真实性。通过饲喂mimic-miR-79和inhibitor-miR-79对意大利蜜蜂工蜂4-6日龄幼虫肠道内的ame-miR-79分别进行过表达和敲减。采用相关生物信息学软件进行ame-miR-79的靶基因预测与分析。通过RT-qPCR检测ame-miR-79的过表达和敲减效果及过表达和敲减ame-miR-79后靶基因的相对表达量。【结果】ame-miR-79在意大利蜜蜂工蜂幼虫肠道内真实存在。与无义模拟物(nonsense mimic, mimic-NC)组相比,mimic-miR-79组的4-6日龄幼虫肠道内ame-miR-79的表达量皆极显著上调;与无义抑制物(nonsense inhibitor, inhibitor-NC)组相比,inhibitor-miR-79组的4和5日龄幼虫肠道内ame-miR-79的表达量显著下调,6日龄幼虫肠道内ame-miR-79的表达量极显著下调。ame-miR-79共靶向303个基因,涉及27个GO条目和179条KEGG通路。相较于mimic-NC组,靶基因细胞色素P450基因CYP450在mimic-miR-79组的4和5日龄幼虫肠道内均极显著下调表达,而在6日龄幼虫肠道内上调表达;靶基因fringe糖基化转移酶(fringe glycosyltransferase, FG)基因在4日龄幼虫肠道内下调表达,在5日龄幼虫肠道内显著下调表达,而在6日龄幼虫肠道内上调表达。相较于inhibitor-NC组,CYP450在inhibitor-miR-79组的4日龄幼虫肠道内极显著上调表达,在6日龄幼虫肠道内上调表达,而在5日龄幼虫肠道内下调表达;FG的表达水平在4日龄幼虫肠道内显著上调,在5和6日龄幼虫肠道内极显著上调。【结论】ame-miR-79在意大利蜜蜂工蜂幼虫肠道内真实存在;通过饲喂模拟物和抑制物能分别实现意大利蜜蜂工蜂幼虫肠道内ame-miR-79的有效过表达和敲减;ame-miR-79负调控意大利蜜蜂工蜂幼虫肠道内CYP450和FG的表达。