人p53启动子萤光素酶报告基因的构建及其活性测定

目的：克隆p53基因的启动子,插入萤光素酶报告基因载体,并检测启动子活性。方法：采用PCR技术从人肝癌细胞系HepG2基因组中扩增人p53启动子,插入萤光素酶报告基因载体pGL4．0-empty,将重组质粒转染293T、ZR75-1、HepG2、A549细胞,测定p53启动子的转录活性。结果：构建了p53启动子的萤光素酶报告基因;通过测序及质粒酶切鉴定,所构建的p53启动子正确;活性实验表明,报告基因在多种细胞中显示构建的p53启动子活性,并呈现一定的剂量效应;转录因子USF能以剂量效应方式提高p53报告基因的转录活性。结论：克隆了人p53启动子,为进一步研究调控p53的转录因子奠定了基础。     

混合喂养法建立成年营养性肥胖大鼠模型

目的:尝试用混合喂养法建立一种与临床相仿的成年营养性肥胖大鼠模型。方法:55只8周龄SD大鼠随机分为对照组10只(普通饲料喂养)和实验组45只(混合喂养),喂养2周后实验组剔除肥胖抵抗大鼠。每周记录大鼠体重,喂养9周后观察两组大鼠体重、体长、Lee's指数、空腹血糖(FBG)、血脂、葡萄糖耐量水平和肝脏组织病理改变。结果:喂养第9周末,实验组大鼠和对照组大鼠体重分别为(645.6±34.8)g和(483.3±31.5)g,Lee's指数分别为(326.3±24.2)和(302.7±19.8),组间比较有显著差异(P0.05)。实验组血清甘油三酯(TG)、总胆固醇(TC)及低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、FPG、糖负荷后30、60、120分钟血糖均明显高于对照组,差异有统计学意义。HE染色病理结果显示实验组大鼠肝脏均出现脂肪样变,而对照组未见明显变性。结论:本研究所应用的混合喂养法可以稳定成功地建立伴有葡萄糖耐量减低和高脂血症的成年营养性肥胖大鼠模型。     

人激活转录因子5基因真核表达载体的构建及其生物学功能研究简

目的：构建带myc标签的人激活转录因子5（ATF5）的真核表达载体,获得myc-ATF5融合蛋白,并对其生物学功能进行初步检测。方法：以本实验室保存的带有XL5标签的ATF5质粒为模板,采用PCR技术扩增ATF5编码序列,将其插入pXJ-40-myc载体中,Western印迹检测其表达;将重组质粒与空载体分别转染人胚肾293T细胞,通过Western印迹和qRT-PCR检测其下游基因哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）在蛋白和mRNA水平的变化。结果：双酶切和测序结果表明myc-ATF5真核表达质粒构建成功,转染293T细胞后获得表达;Western印迹和qRT-PCR证明myc-ATF5可升高roTOR的转录和蛋白水平。结论：构建了带myc标签的人ATF5真核表达载体,为进一步研究ATF5在自噬中的功能奠定了基础。     

慢病毒介导的mTOR敲低肝癌细胞株HepG2的构建及初步功能检测

目的:建立高效稳定的哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)小干扰RNA(siRNA)细胞导入方法,并对mTOR敲低的HepG2肝癌细胞株的功能进行初步检测。方法:构建了2条不同的人mTOR慢病毒siRNA载体pLenti-H1/mTOR siRNA,与3个包装质粒共转染293T细胞,包装成慢病毒后感染HepG2细胞;经嘌呤霉素筛选2周后,收集细胞进行Western印迹,检测mTOR敲减效果及其下游基因c-myc、周期蛋白D1(cyclinD1)表达水平及4E-BP1、S6K1磷酸化水平的变化。结果:RT-PCR和Western印迹结果显示,构建的pLenti-H1/mTOR siRNA能有效抑制mTOR基因的表达,敲低了mTOR蛋白水平,且沉默mTOR后其下游基因c-myc、CyclinD1的表达水平及4E-BP1、S6K1磷酸化水平降低。结论:构建了慢病毒介导RNA干扰mTOR表达载体,为进一步研究mTOR通路奠定了实验基础。     

末梢血酮与尿酮在糖尿病酮症诊治中的临床应用价值比较

目的:比较末梢血酮即β-羟丁酸与尿酮在糖尿病酮症诊断和监测方面的临床价值。方法:收集2013年10月至2014年12月我院内分泌科收治的随机末梢血糖13.9 mmol/L的糖尿病患者161例,根据尿酮是否阳性分为糖尿病酮症患者29人,非糖尿病酮症患者132人。比较患者末梢血酮、尿酮的相关性;通过受试者工作特征曲线(ROC)寻找血酮诊断糖尿病酮症的诊断切点;比较血酮和尿酮对监测治疗反应性的优缺点。结果:糖尿病患者血酮和尿酮水平呈显著正相关,血酮随尿酮增加而增加(r=0.493,P0.001),而二者与血糖水平均无明显相关性(P=0.358,P=0.133)。以尿酮为糖尿病酮症诊断标准,ROC曲线下面积0.843(CI,0.746-0.939),末梢血酮诊断酮症的界值为0.25 mmol/L。在监测糖尿病酮症患者治疗的过程中,血酮较尿酮达峰更快,转阴更早。结论:血酮与尿酮有较好相关性,末梢血酮检测有良好的敏感性、及时性和精确性,对治疗策略有更好的指导意义,建议临床推广。