单细胞技术在干细胞研究中的应用

干细胞是具有自我更新和分化潜能的异质性细胞群体。基于细胞群体水平的干细胞研究不能满足深入认识干细胞生物学本质及实际应用的需要。近年来,单细胞相关技术不断发展和成熟,并正在干细胞基础研究及其相关领域中获得迅速应用。该文以造血干细胞为主要例举,就实验研究中常用的单细胞分离、单细胞克隆分析、单细胞移植、单细胞实时定量PCR及单细胞测序等技术原理及其应用进行综述。     

长非编码RNA-UCA1影响红细胞增殖

造血是一个高度协调、精密调控的过程。在正常造血分化过程中, lncRNA不仅调控造血干/祖细胞自我更新、分化、凋亡等过程,还决定造血谱系分化命运。关于lncRNA在人的不同造血谱系分化中的功能以及作用机制的研究已比较深入,但其在红系分化过程中的功能和机制的研究很少,仍处于建立差异基因表达谱的阶段。现有的研究表明, lncRNA-UCA 1(urothelial cancer associated 1)作为原癌基因与多种癌症的发生、发展、转移、产生化疗耐药性等密切相关。该研究发现,在体外诱导脐带血来源的CD34+干/祖细胞向红细胞分化的过程中,采用慢病毒感染的方法敲降UCA 1的表达抑制了红细胞的增殖及活力,对RNA-seq数据进一步分析发现,降低UCA 1的表达会影响与细胞周期相关基因的表达。     

SETD8~(–/–)抑制人胚胎干细胞向造血分化

表观遗传调控作为一种广泛的基因表达调控方式,已被报道可以参与干细胞多能性、谱系分化等生物学过程。虽然许多表观遗传调控因子的功能已被解析,但仍有一些并未被深入研究。SETD8(赖氨酸甲基转移酶5A, lysine methyltransferase 5A)作为一种甲基化转移酶,已被证实能够介导组蛋白H4第20位赖氨酸的单甲基化,并且可以参与细胞周期、P53介导的DNA损伤等过程。但是, SETD8是否可以直接调控人胚胎干细胞的多能性及其谱系分化还没有报道。该研究首先利用CRISPR/Cas9基因编辑技术在人的胚胎干细细胞中敲除SETD8。功能研究表明,敲除SETD8显著降低了多能性基因OCT4和NANOG的表达水平,并且抑制了体外造血发育过程。接着利用了siRNA在造血发育不同时期敲低STED8,发现均可以抑制造血发育过程,进一步证实了SETD8可以在各个阶段调控体外造血发育。     

碳酸酐酶在红细胞分化发育过程中的功能研究

目前红系分化调控相关的研究主要集中在细胞因子、转录因子、lncRNA及表观遗传方面,为了对红系分化调控机制进行更加深入的解析,研究了碳酸酐酶在红系分化中的功能。碳酸酐酶可以高效催化二氧化碳的水合,但它在红细胞发育过程中的功能尚不清楚。利用脐带血来源的CD34⁺细胞在体外进行红细胞诱导分化,在分化过程中通过慢病毒介导的基因敲降的方法能够降低碳酸酐酶1和碳酸酐酶2的表达,并使用流式细胞仪检测红细胞的生成和分化效率。研究结果表明,与对照组相比,碳酸酐酶1的表达缺陷使红细胞的晚期分化明显受阻,而碳酸酐酶2的表达缺陷则将红细胞的分化阻滞在早期阶段。研究结果表明,虽然作用窗口不同,但碳酸酐酶1和碳酸酐酶2在红系分化的过程中均发挥着重要的调控作用,这一发现对将来在体外红细胞生成具有指导意义。     

CD3ε和PMA对fas基因转录调控作用的研究

研究了ＣＤ３ε和ＰＭＡ对细胞凋亡基因ｆａｓ的转录调控作用．根据已知的人ｆａｓ基因５＇上游序列设计引物,用ＰＣＲ法从人胸腺细胞基因组ＤＮＡ中扩增出ｆａｓ５＇上游长为４４６ｂｐ的启动子片段．将此片段定向克隆到以虫荧光素酶为报告基因的真核细胞表达载体ｐＸＰ２中．经限制性内切酶酶切鉴定及序列测定分析表明此重组表达质粒ＤＮＡ的结构和序列正确．用此质粒（ｐＸＰ２－ｆａｓｕｐ）瞬时转染人ＪｕｒｋａｔＴ淋巴细胞,分析报告基因的表达水平．结果表明ｆａｓ基因上游－５０６到－６０的区域有弱启动子活性,约是阴性对照的１．５倍．抗ＣＤ３ε抗体和ＰＭＡ处理均可增强ｆａｓ启动子的活性,促进报告基因的表达,其虫荧光素酶活性分别是未经处理的ｐＸＰ２－ｆａｓｕｐ转染细胞的１．７倍和３．３倍,但二者没有协同作用．ＰＫＣ的抑制剂ｓｔａｕｒｏｓｐｏｒｉｎｅ和ＰＴＫ的抑制剂ｈｅｒｂｉｍｙｃｉｎＡ可抑制ＰＭＡ诱导的ｆａｓ基因转录,使虫荧光素酶基因的表达降至未用ＰＭＡ处理的水平．但ＰＴＫ的另一种抑制剂ｇｅｎｉｓｔｅｉｎ可与ＰＭＡ发挥协同作用,上调ｆａｓ基因的转录,使虫荧光素酶活性增加到５倍．这些结果为阐明ＣＤ３ε及ＰＭＡ介导Ｔ淋巴细胞激活和凋亡的分子机制     

利用CRISPR/Cas9技术构建敲除MEIS2基因的HEK293T人胚肾细胞系

CRISPR/Cas9系统作为一种新型的基因组编辑技术,利用人工设计的向导RNA(singleguide RNA,sg RNA)介导外源表达的Cas9蛋白与基因组靶点特异性结合以实现对基因组DNA的特异性切割,切割后的基因组DNA通过非同源末端连接或同源重组的方式进行修复,从而实现基因的敲除、敲入等。MEIS2属于一类高度保守的同源盒转录因子MEIS家族,研究发现,MEIS2广泛参与胚胎的早期发育及肿瘤的发生发展,但其发挥作用的机制目前还不是很清楚。该研究针对MEIS2基因作用的功能域,设计两个靶向MEIS2基因Exon3和Exon8的sg RNA,通过SURVEYOR分析及Western blot检测,确认了所设计sg RNA的有效性。进一步通过细胞分选及Western blot检测筛选出稳定敲除MEIS2基因的HEK293T细胞株。最后,通过序列测定确认MEIS2发生了移码突变。综上所述,该研究利用CRISPR/Cas9技术成功建立了完全敲除MEIS2的HEK293T细胞株,为研究MEIS2的功能和作用机制提供了有效工具。     

组蛋白甲基转移酶SETD2研究进展

SETD2基因是调控哺乳动物表观遗传的一个重要基因,其编码的SETD2蛋白主要参与组蛋白甲基化修饰,与RNA聚合酶II作用介导转录延长及错配修复。小鼠SETD2结构异常通过下调H3K36me3而引起血管构建功能缺陷。在许多人类肿瘤(乳腺癌、肾癌及膀胱肿瘤等)中都发现了SETD2基因改变。近年来的研究表明,SETD2基因表达下调可促进白血病干细胞的自我更新,从而促进白血病的发生和发展。SETD2-H3K36me3信号通路可认为是肿瘤中常见的一种抑癌机制,这也为临床疾病诊断和治疗提供了新策略。但是,关于SETD2异常引起肿瘤的具体作用机制需要进一步研究。该文就SETD2基因的结构、功能及其在胚胎发育及成体肿瘤尤其是白血病中的作用机制作一综述。     

白血病细胞系来源的P2X7受体的功能研究

P2X7受体是ATP门控的离子通道。从白血病细胞系J6-1细胞中扩增P2X7受体编码区全序列,克隆到pTARGET真核表达载体,经DNA序列分析后转染Ramos细胞,获得稳定表达细胞株;应用RT-PCR、Westernblot和流式细胞术检测P2X7受体在Ramos中的表达;荧光分光光度计检测P2X7受体介导的胞内钙离子浓度变化。结果显示,J6-1细胞来源的P2X7受体在第559位有一个A→G的有义突变,导致Asn187→Asp187,可在Ramos细胞中表达,在特异性激动剂BzATP作用下可引起胞内钙离子浓度的升高,但所需激动剂浓度高于常规浓度。     

利用ES细胞建立可诱导的白血病模型

胚胎干细胞（embryonic stem cells,ESCs）是从囊胚的内细胞团分离出来的多潜能干细胞,具有多向分化的能力。将外源基因导入ES细胞建立转基因动物,对于研究外源基因的功能和调控具有一定的价值。载有外源性基因的病毒在感染ES细胞后,可通过囊胚注射获得具有胚系遗传的该转基因动物,并且这一外源基因可以稳定遗传和表达。该研究主要是利用携带hPML-RARα基因的慢病毒感染小鼠ES细胞系（R1）,获得携带该基因的ES细胞,感染后的ES细胞核型正常。在此基础上,将感染后的ES细胞经囊胚注射,获得了携带有hPML-RARα基因的3只嵌合小鼠,其中,有1只具有遗传特性。对嵌合体小鼠与C57杂交的后代给予强力霉素（doxycycline）处理,3天以后骨髓细胞hPML-RARα基因开始表达,这证明了在小鼠体内该外源基因表达的可诱导性。以上证实,已经成功利用ES细胞建立了可诱导的白血病转基因小鼠模型。     

Flk1+间充质干细胞减轻四氯化碳导致的肝纤维化的研究

许多慢性肝脏疾病都会发生肝纤维化,但是目前尚缺乏对肝纤维化切实有效的治疗手段。实验发现,Flk1(fetalliverkinase)阳性间充质干细胞(MSC)能够减轻四氯化碳(CCl₄ )所致小鼠肝纤维化。取雄性BALB c小鼠骨髓,分离培养Flk1⁺ MSC ,用CCl₄ 制作雌性小鼠肝纤维化模型,在CCl₄ 损伤后立即或1周后经尾静脉注射Flk1⁺ MSC ,2或5周后检测受体小鼠肝脏的纤维化程度和供体细胞的植入。结果发现,CCl₄ 损伤后立即注射Flk1⁺ MSC ,可以使肝脏损伤程度明显减轻,减少胶原沉积,使肝脏羟脯氨酸含量及血清纤维化指标显著下降;而损伤1周后注射细胞则无明显变化。免疫荧光、PCR和荧光原位杂交方法证实,在受体肝脏中有供体细胞植入,呈上皮细胞形态,并表达白蛋白,但是数量很少。因此,Flk1⁺ MSC具有潜在的植入肝组织的能力,并可能启动肝组织的内源性修复,减轻CCl₄ 导致的肝纤维化。