利用CRISPR/Cas9技术建立诱导性敲除MEIS1基因的HEK293T细胞株

CRISPR/Cas9是新一代基因组编辑技术,可简便快捷地在哺乳动物细胞对基因进行敲除、敲入。但常规的CRISPR/Cas9表达系统直接转染效果差、病毒包装效率低,极大地限制了CRISPR/Cas9系统的广泛使用。该研究应用Tet-on系统,建立了Dox诱导Cas9表达的293T细胞株,命名为293T-i Cas9。MEIS1(myeloid ectropic viral integration site 1)是TALE(three amino acid loop extension)同源域家族的转录因子,其在白血病发生发展、胚胎造血系统发育及神经系统发育中有重要作用,但其作用机制仍未完全明确。将靶向MEIS1 Exon3的sg MEIS1表达载体转入293T-iCas9,SURVEYOR实验和Western blot检测结果表明,sg MEIS1有效地指导Cas9进行基因组编辑。最终经测序和Western blot结果证明,成功建立了MEIS1敲除细胞株,这为研究MEIS1的功能提供了重要的工具。     

利用CRISPR/Cas9n系统敲除人源SNF5基因

目的:建立敲除人源基因组中SNF5基因的CRISPR/Cas9n系统。方法:设计一对靶向人源SNF5基因第1个外显子的sg RNA,分别克隆至p X461、p X462表达载体后,转入人胚肾293T细胞,通过Western印迹检测细胞株中SNF5基因的敲除效果。结果:测序证明构建的靶向SNF5基因CRISPR/Cas9n重组质粒与设计吻合。Western印迹结果显示,重组质粒p X461-h SNF5sg RNA转染293T细胞后24 h,细胞内SNF5表达水平明显降低;重组质粒p X462-h SNF5sg RNA转染293T细胞后48 h,细胞内SNF5表达水平显著降低。结论:通过CRISPR/Cas9n系统获得了靶向SNF5基因的重组质粒,构建的重组质粒能有效敲除SNF5基因的表达。     

建立CRISPR/Cas9慢病毒系统高效敲除人源AIP1基因

旨在构建AIP1基因CRISPR/Cas9敲除体系,获得高效、稳定、永久性AIP1敲除的人胚肾细胞株(293T)。针对AIP1的外显子设计3个20 bp的sg RNA(sp1、sp2和sp3)。与PX458载体连接,构建PX458-sg RNA敲除表达载体。T7E1实验评估敲除效率。将敲除效率最高的sg RNA与lenti CRISPRv2慢病毒载体连接,构建lenti CRISPRv2-sg RNA敲除表达载体,将阳性重组质粒导入病毒包装细胞293T中,收集病毒上清液转染293T细胞。对敲除成功的293T细胞通过有限稀释法构建敲除AIP1基因的稳定细胞株。Western blot测定转染后293T细胞中AIP1蛋白的表达量。结果显示,测序证实AIP1的3个靶序列分别正确插入PX458表达载体中,T7E1实验证实AIP1sg RNAsp2靶向敲除效率最高;成功构建lenti CRISPRv2-sg RNAsp2 AIP1敲除表达载体,并包装病毒,感染293T细胞;Western blot证实获得稳定的AIP1基因表达缺失的293T细胞株。建立了能稳定敲除AIP1基因的CRISPR/Cas9慢病毒系统,成功获得AIP1敲除的293T稳定细胞株。     

利用CRISPR/Cas9构建G6PD基因c.1388G>A突变的HEK293/K562细胞株

该文旨在利用CRISPR/Cas9构建G6PD基因c.1388GA突变的HEK293/K562细胞株,为G6PD缺陷症及其修复研究提供细胞模型。针对G6PD基因c.1388GA位点设计单链向导RNA(sg RNA)与突变同源臂,利用CRISPR/Cas9联合同源重组修复(HDR)构建G6PD基因c.1388GA突变的HEK293细胞株与红白血病K562细胞株; qRT-PCR、Western blot检测G6PD基因表达; CCK8检测细胞增殖;G6PD/6PGD比值法检测G6PD酶活性;结晶紫染色与Annexin V-APC/7-AAD验证突变细胞株对氧化活性药物维生素K3与伯安喹的耐受情况。结果显示,成功构建CRISPR/Cas9双质粒载体系统;筛选单克隆细胞经测序鉴定显示,成功构建G6PD基因c.1388GA突变的HEK293与K562细胞株,且无脱靶;进一步发现, c.1388GA突变不影响HEK293与K562细胞G6PD基因mRNA转录与蛋白翻译,但细胞增殖减慢, G6PD酶活性下降;突变HEK293细胞对维生素K3与伯安喹的耐受力减弱,突变K562细胞对伯安喹耐受能力减弱。该研究成功构建G6PD基因c.1388GA突变的HEK293与K562细胞株,为G6PD缺陷症及后期基因修复研究提供细胞模型。     

应用CRISPR/Cas9系统构建MTHFD1基因敲除的HEK-293细胞系

目的:利用成簇的、规律间隔的短回文重复序列/Cas9核酸酶(CRISPR/Cas9)基因编辑技术构建亚甲基四氢叶酸脱氢酶1(methylenetetrahydrofolate dehydrogenase 1, MTHFD1))基因敲除人胚肾(HEK-293)稳定细胞系。方法:利用在线软件筛选出评分最高的3条针对MTHFD1基因的单向导RNA (sg RNA),然后合成sg RNA序列并将其插入到含有GFP标签的质粒中;重组质粒转染HEK-293细胞后通过流式细胞仪分选出已被转入sg RNA的单细胞,通过测序确认单克隆细胞系中MTHFD1的DNA序列突变状态;最后应用实时荧光定量多聚核苷酸链式反应(real-time quantitative Polymerase Chain Reaction, RT-q PCR)和蛋白质印迹(Western blot)方法检测单克隆细胞中MTHFD1的m RNA和蛋白表达水平。结果:重组载体中含有正确的sg RNA序列;测序结果显示该细胞系中MTHFD1基因发生了单个碱基插入突变和6个碱基的缺失突变;RT-qPCR结果显示单克隆细胞系中MTHFD1在m RNA水平显著降低;Western blot检测成功构建MTHFD1蛋白缺失的HEK-293细胞。结论:本研究利用CRISPR/Cas9技术成功构建的MTHFD1敲除HEK-293细胞系。     

CRISPR/Cas9介导的CD34报告基因293AD细胞系的构建

CRISPR/Cas9技术作为一项新起的基因工程技术,在细胞及动物模型基因的编辑修饰中起着越来越重要的角色。CRISPR相关Cas9核酸酶可在特殊设定的单一导向RNA(single guide RNA,sg RNA)的引导下造成基因组DNA双链断裂(DSBs),从而引起同源重组修复(HDR)。利用这种特性,我们构建出了带有CD34-GFP报告基因的293AD细胞系。根据CD34基因组序列,我们设计出了针对CD34基因特异性的单向导向RNA(sg RNA)和带有CD34-GFP报告基因的外源性同源序列。在与Cas9共转染之后,利用嘌呤霉素筛选出基因组DNA中插入有CD34-GFP报告基因的293AD细胞。之后我们对筛选出的293AD细胞进行单细胞分选,并利用PCR扩增对CD34绿色荧光报告基因的插入进行了验证。最后,我们将PCR扩增结果阳性的单克隆293AD细胞系的基因组进行DNA测序。DNA测序结果显示,分选出来的细胞基因组里确实包含有CD34-GFP报告基因。最终,我们成功利用CRISPR/Cas9系统构建出了绿色荧光标记的CD34报告基因293AD细胞系,为后续人体细胞诱导去分化成造血干细胞提供了有利的工具。     

基于CRISPR/Cas9技术构建Cyr61敲低HEK293T稳定细胞株及其生物学功能检测

为了探讨Cyr61的生物学功能,该研究利用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建Cyr61敲低的HEK293T稳定细胞株,并在体外研究Cyr61对HEK293T细胞增殖和凋亡的影响。根据CRISPR/Cas9靶点设计原则,应用http://crispr.mit.edu/在线设计3条Cyr61的导向RNA(guideRNA,gRNA),用LentiCRISPRv2作为载体构建LentiCRISPRv2-gRNA重组质粒并转化至感受态的Stbl3菌体中,经筛选后包装成Cyr61 CRISPR/Cas9 KO质粒,利用Cyr61 CRISPR/Cas9 KO质粒和HDR质粒转染HEK293T细胞,加入嘌呤霉素(8μg/mL)进行筛选,通过实时荧光定量PCR技术及蛋白质免疫印迹(Western blot)鉴定出HEK293T敲低Cyr61细胞株;常规培养细胞,利用细胞计数检测试剂盒(CCK8)检测细胞增殖情况,流式细胞技术检测细胞凋亡情况。该研究成功构建出Cyr61敲低HEK293T细胞株,与对照组相比,Cyr61敲低细胞株的增殖明显升高(P0.05),凋亡率明显减少(P0.05)。通过CRISPR/Cas9基因编辑系统成功构建Cyr61敲低HEK293T稳定细胞株,为研究Cyr61基因提供了有效的工具。     

基于CRISPR/Cas9系统对斑马鱼hoxb4基因的编辑及其突变体基因型的初筛

采用高效基因编辑系统CRISPR/Cas9构建hoxb4基因敲除斑马鱼模型,进行hoxb4基因功能的研究。根据hoxb4基因的一号外显子的正义链及反义链设计3个长20 bp的sg RNA,分别靶向ExonⅠ的192#位点,244#位点及313#位点。化学合成sg RNA的寡核苷酸序列,经过酶切克隆进p T7-g RNA质粒中,构建g RNA的体外转录载体并通过体外转录得到靶位点的g RNA。将质粒p SP6-2s NLS-sp Cas9线性化然后在体外转录得到Cas9的m RNA并进行加A尾,将以上靶位点的g RNA与Cas9的m RNA共注射入单细胞期的斑马鱼胚胎内,提取基因组DNA,PCR扩增出目的基因片段并使用T7EI酶切测效,最后将PCR产物连入p MD19-T simple载体中,挑取阳性克隆进行菌落PC R鉴定,然后经Sanger测序检测突变类型。结果显示,靶位点的sg RN A寡核苷酸双链成功连入p T7-g RNA质粒中且序列正确;其中靶向ExonⅠ的313#位点的sg RNA可成功编辑斑马鱼hoxb4基因,T7 EⅠ检测其敲除效率高达26.5%,并测序得到4种阳性突变型。通过CRISPR/Cas9系统成功编辑斑马鱼hoxb4基因并测序鉴定其突变类型,为HOXb4基因功能的研究提供了可靠的基因敲除方法。     

运用改良的CRISPR/Cas9系统建立HtrA2敲除细胞株

能识别特定基因组DNA序列的核酸酶是基因编辑的重要工具。在单链RNA引导下,来源于一种产脓链球菌的成簇规律间隔短回文重复(clustered regularly interspaced short palindromic repeats,CRISPR)关联蛋白(CRISPR-associated protein 9,Cas9)能够发挥其核酸酶功能对基因组特定序列进行剪切。这种功能依赖于单链引导RNA(single-guide RNAs,sg RNAs或g RNAs)中20 nt的核心靶向序列。在该研究中,作者对已有的CRISPR/Cas9系统载体进行了优化,简化了g RNA表达载体的构建。运用优化后的CRISPR/Cas9系统,我们敲除了HEK293T细胞中HtrA2基因的第一个外显子。这一改进大幅度降低了CRISPR/Cas9技术的使用成本。     

利用CRISPR/Cas9系统构建稳定敲除anxa6基因的Caco-2细胞株

【目的】利用CRISPR/Cas9系统构建稳定敲除anxa6基因的Caco-2细胞株,为研究大肠杆菌O157:H7效应蛋白Esp F与宿主膜联蛋白A6 (ANXA6)相互作用及其致病机制奠定基础。【方法】根据CRISPR/Cas9靶向原理设计并合成3个特异性识别anxa6基因的向导RNA (single guide RNA,sgRNA),基于Lenti CRISPRv2载体构建Lenti CRISPRv2-sg RNA重组质粒,转入293T细胞中,制备sgRNA-Cas9慢病毒,将慢病毒感染Caco-2细胞,经嘌呤霉素筛选阳性细胞,有限稀释法分离培养单克隆细胞,提取单克隆细胞基因组DNA,并对敲除位点附近的DNA片段进行PCR扩增,测序并进行脱靶效应评估;免疫印记法检测ANXA6蛋白表达情况,细胞计数试剂盒8 (cell counting kit 8,CCK8)试剂盒检测细胞增殖能力,免疫荧光法检测细胞紧密连接分布情况。【结果】Western blotting及序列测序表明anxa6基因敲除单克隆细胞构建成功;脱靶效应评估结果显示预测的10个脱靶位点均无脱靶现象;基因敲除对细胞增殖能力...     

敲除ESR1基因对人乳腺癌细胞侵袭能力的影响

目的:建立CRISPR/Cas9系统用于敲除人源雌激素受体α(ERα)基因(ESR1),并利用此细胞模型初步检测ESR1基因对乳腺癌细胞侵袭能力的影响。方法:设计一个靶向人源ESR1基因第2外显子的单向导RNA(sg RNA),分别克隆表达载体后,通过慢病毒转入人乳腺癌细胞株MCF-7,Western印迹检测MCF-7中ESR1基因的敲除效果,通过Transwell、反向侵袭试验观察ESR1基因敲除后对细胞侵袭能力的影响。结果:测序结果显示靶向ESR1基因CRISPR/Cas9重组质粒构建成功;Western印迹显示Cas9-ERα组的MCF-7细胞内ERα表达水平较对照组显著降低;Tanswell、反向侵袭试验证实ESR1基因敲除能够促进乳腺癌细胞的侵袭能力。结论:通过CRISPR/Cas9系统获得了靶向ESR1基因的重组质粒,构建的重组质粒能有效敲除ESR1基因;ERα能够抑制乳腺癌细胞的侵袭能力。     

应用CRISPR/Cas9技术敲除小鼠海马神经元中Purα基因可减弱神经元对DNA损伤的修复作用

人转录活化因子Purα是体内重要的转录因子,在体内多个环节中都发挥着重要的作用,尤其是在神经系统中,它与神经元的发育,突触形成都有很密切的关系。该文通过构建Purα基因敲除的小鼠海马神经元细胞系来观察其在DNA损伤修复中的作用。根据目的基因靶向删除外显子的位置设计相应的sg RNA序列,合成相应的寡核苷酸后克隆在p Sp Cas9(BB)-2A-Puro(PX459)V2.0质粒载体相应位点上,从而构建能对Purα基因进行敲除的CRISPR/Cas9质粒,将构建好的质粒通过酶切和测序进行鉴定,将经过鉴定证实相位正确及在有sg RNA序列插入的阳性质粒转染到小鼠海马神经元(HT22)细胞中,加入嘌呤霉素进行抗性筛选,保留正常生长的细胞进行培养,从而建立能稳定地进行Purα基因敲除的细胞系。通过Real-time PCR和Western blot技术分别在转录和翻译水平上检测Purα基因的表达情况,从而来判定Purα基因的敲除效率;将所构建的Purα基因敲除的细胞用羟基脲(HU)进行处理来建立细胞DNA损伤的实验模型,通过Western blot、脉冲电场反转凝胶电泳实验及细胞毒性实验观察Purα在DNA损伤修复中的作用。实验结果证实,所插入片段相位正确。通过TA克隆测序和T7E1酶切证实所构建的质粒具有良好的CRISPR/Cas9活性,可导致基因组碱基发生突变,Real-time PCR和Western blot实验结果证实,Purα基因敲除组的Purα基因表达明显降低。Purα基因敲除后,细胞对HU引起的DNA损伤极为敏感,说明Purα在维持基因组DNA的完整性方面发挥着重要的作用,是细胞中一种不可或缺的蛋白质。该实验结果还提示,利用CRISPR/Cs9技术可以有效地对目的基因进行敲除,同时由于该质粒携带有嘌呤霉素抗性基因,利用这一特点,可以方便地建立稳定的细胞系,该细胞系可用作研究Purα基因在神经元中的生物学功能的细胞模型。     

基于CRISPR/Cas9技术的GATA-1基因敲除K562细胞系的构建

GATA-1(GATA binding protein-1)在造血分化过程是最重要的转录调控因子,在红细胞和巨核细胞中特异性高表达,并通过调节相关基因的转录在红系和巨核系造血细胞的分化发育过程中发挥重要作用。该研究采用CRISPR/Cas9技术将K562细胞中的GATA-1基因敲除,建立了GATA-1基因敲除K562细胞株。首先,设计了4个CRISPR的靶向位点,利用p GL3-U6-sg RNA-PGKpuromycin质粒构建了4个导向RNA(single guide RNA,sg RNA)载体。利用电穿孔的方法将sg RNA载体与Cas9载体p ST1374-NLS-fl ag-linker-Cas9共转K562细胞。转染48 h,经定点PCR和T7EN1内切酶酶切鉴定后,采用细胞有限稀释法嘌呤霉素筛选,定点测序和Western blot检测结果显示,成功构建了GATA-1基因敲除K562细胞株,命名为K562-KO GATA-1。使用联苯胺染色和流式细胞术的方法检测血型糖蛋白A(glycophorin A,CD235a)发现,与正常K562细胞相比,K562-KO GATA-1细胞株经Hemin诱导红系分化明显受到抑制。综上,该研究建立了敲除GATA-1的K562细胞系,可用于后续的造血分化相关研究。     

运用CRISPR/Cas9技术敲除人源黏着斑蛋白基因

目的:建立CRISPR/Cas9n系统,用于敲除人源黏着斑蛋白(VCL)基因。方法:设计一个靶向人源VCL基因第3个外显子的单向导RNA(sgRNA),分别克隆表达载体后,通过慢病毒转入人MDA-MB-231细胞,通过PCR及Western印迹检测细胞株中VCL基因的敲除效果。结果:测序结果显示靶向VCL基因CRISPR/Cas9重组质粒构建成功;PCR产物测序结果表明本次设计的Cas9/sgRNA能够对VCL基因进行编辑敲除;Western印迹显示Cas9-VCL组的MDA-MB-231细胞内VCL表达水平较对照组显著降低。结论:通过CRISPR/Cas9系统获得了靶向VCL基因的重组质粒,构建的重组质粒能有效敲除VCL。     

利用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建CDH1基因敲除的人乳腺癌MCF-7稳定细胞系

目的:利用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建CDH1基因缺失的人乳腺癌MCF-7稳定细胞系。方法:根据CRISPR/Cas9靶点设计原则,设计能特异性针对CDH1基因的sgRNA,以lentiCRISPR v2质粒为骨架构建能表达此sgRNA和Cas9蛋白的重组质粒。测序鉴定后,将重组质粒与逆转录病毒包装质粒VSVG、PAX2在氯化钙介导下共同转入HEK293T细胞进行病毒包装,转染48 h后收集病毒上清,直接感染人乳腺癌MCF-7细胞。采用嘌呤霉素筛选CDH1缺失的乳腺癌MCF-7细胞,通过DNA测序、Western印迹及免疫荧光染色实验验证获得的MCF-7细胞。结果:构建了靶向CDH1的CRISPR/Cas9质粒;DNA测序和Western印迹实验结果表明获得了稳定敲除CDH1的人乳腺癌MCF-7细胞。免疫荧光染色结果显示,相比对照组,稳定敲除CDH1的MCF-7细胞中已无法明显观察到E-钙黏蛋白的表达分布。结论:通过CRISPR/Cas9基因编辑技术构建了CDH1基因缺失的MCF7细胞系,为进一步研究CDH1在肿瘤免疫治疗中的作用提供了基础。     

CRISPR/Cas9切割痘病毒DNA抑制病毒复制

当前,CRISPR/Cas9系统靶向痘苗病毒的相关研究鲜有报道。该文采用了CRISPR/Cas9基因组定点编辑技术,以痘病毒为研究对象。在重组痘病毒WR-EGFP中针对EGFP基因序列设计不同靶点g RNAs,转染Cas9/g RNA质粒,同时感染WR-EGFP痘病毒,随后观察EGFP荧光表达、提取病毒基因组,通过PCR进行切口鉴定并运用错配酶切法验证CRISPR/Cas9对痘病毒靶点DNA切割的切口修复情况。与单独感染WR-EGFP组相比,转染了Cas9/g RNA174和Cas9/g RNA175质粒的EGFP荧光强度明显降低,表明CRISPR/Cas9抑制WR-EGFP病毒中EGFP基因的表达。相对定量PCR及错配酶切实验结果显示,CRISPR/Cas9切割靶点导致WR-EGFP病毒基因组产生了切口,并且存在DNA错配修复现象。最后,通过结晶紫染色法测定痘病毒的滴度,结果显示,经CRISPR/Cas9处理组的痘病毒滴度显著下降,即CRISPR/Cas9能够使痘病毒的复制能力显著地降低。综上所述,CRISPR/Cas9切割痘病毒基因组DNA并且抑制痘病毒复制。     

PGRN和Rev-erbβ双基因敲除HEK 293细胞系的构建及应用

为研究PGRN与Rev-erbβ相互作用可能存在的分子机理及其生理意义,在前期构建的Rev-erbβ基因敲除HEK293 C3-6细胞系的基础上,利用CRISPR/Cas9技术构建PGRN和Rev-erbβ双基因敲除的HEK293细胞系。首先,针对PGRN基因设计了4个不同的sgRNA,经筛选将活性较高的PGRN sgRNA 2和sgRNA 3串联,构建携带双PGRN sgRNA和Cas9的慢病毒打靶载体pLenti/CMV-Loxp-Cas9-sgRNA2-U6-sgRNA3-U6-Loxp-EF1α-Puro。再将包装的携带Cas9和双PGRN sgRNA的慢病毒感染HEK293(Rev-erbβ~(-/-))细胞,通过筛选、克隆化及测序分析获得双基因敲除的HEK293 C3-6/23(Rev-erbβ~(-/-);PGRN~(-/-))单克隆细胞系,并用qRT-PCR和Western blotting检测HEK293(C3-6/23)细胞中PGRN mRNA和蛋白质的表达。最后,在双基因敲除HEK293(C3-6/23)细胞系中,通过回补基因方式研究PGRN介导Rev-erbβ对靶基因启动子转录活性调控研究。在PGRN和Rev-erbβ双基因敲除的HEK293(C3-6/23)细胞系中,PGRN基因的两条DNA链均为缺失突变型,PGRN mRNA和蛋白质的表达均未达到检测水平。同时在HEK293(C3-6/23)细胞系中研究发现PGRN与Rev-erbβ相互作用,可以增强Rev-erbβ对靶基因启动子转录的调控。利用CRISPR/Cas9系统,成功构建了双基因敲除的HEK293(Rev-erbβ~(-/-);PGRN~(-/-))C3-6/23单克隆细胞系。利用该敲除细胞系研究发现PGRN可以影响Rev-erbβ对靶基因启动子转录的调控,但PGRN参与介导Rev-erbβ转录调控的机制还有待进一步研究。     

CRISPR/Cas9慢病毒系统敲除胰岛β细胞PKA C-α的研究

利用CRISPR/cas9系统建立稳定敲除PKA C-α基因的INS-1细胞株,研究PKA C-α在胰岛β细胞中的功能。设计2个长25 bp且分别靶向PKA C-α基因的exon 5和exon 7的sgRNA,将其克隆至LentiCRISPRv2-sgRNA质粒并转染至293T细胞中制备sgRNA-Cas9慢病毒,慢病毒感染INS-1细胞,嘌呤霉素筛选出阳性细胞并采用有限稀释法筛选单克隆细胞,Western blotting印记法检测单克隆细胞中PKA C-α蛋白的表达水平,测序确认单克隆细胞中PKA C-α基因的突变位点。WB实验证实靶向Exon 5的sgRNA可成功敲除PKA C-α基因,得到稳定敲除PKA C-α基因的细胞株,测序结果表明该细胞株的PKA C-α基因发生1 bp碱基插入突变,并且敲除PKA C-α基因的INS-1细胞胰岛素分泌能力下降。本实验利用CRISPR/Cas9系统成功敲除INS-1细胞中的PKA C-α基因,为研究PKA C-α在胰岛β细胞中的功能奠定了基础。     

利用CRISPR/Cas9n double nick系统构建人DNAH2基因敲除的U2OS细胞株

基于CRISPR/Cas9n double nick技术构建人DNAH2(Homo sapiens dynein,axonemal,heavy chain 2)基因敲除的U2OS稳定细胞株,旨在研究DNAH2基因的生物学功能。首先设计并合成A、B两个sg RNA(Single guide RNA)以及各自的互补链,退火连接形成DNAH2 sg RNA-A、B双链,再分别与带有BbsⅠ粘性末端的p X462线性载体相连,形成p X462-DNAH2-A、p X462-DNAH2-B重组真核表达质粒。质粒共转染至U2OS细胞后,加入嘌呤霉素,以有限稀释法获得阳性单克隆细胞株,再以蛋白印迹实验检测DNAH2蛋白的表达,最后通过PCR-基因测序技术分析突变特点。结果显示A、B sg RNA双链成功插入p X462载体,U2OS-DNAH2-KO单克隆细胞株中DNAH2蛋白不表达,DNAH2基因发生移码突变,从而证实利用CRISPR/Cas9n double nick系统成功构建人DNAH2基因敲除的U2OS稳定细胞株,为研究DNAH2基因提供有利工具。