人TRAP1基因的克隆、原核表达及表达条件优化

应用RT-PCR技术,从人白血病多药耐药细胞株K562/ADR中扩增出肿瘤坏死因子受体相关蛋白l(tumor necrosis factor receptor-associated protein1,TRAP1)基因的cDNA.选择Nde I和Xho I分别作为上下游引物的酶切位点,将TRAP1基因克隆到带有6×His标签的pET-28a(+)的载体上.重组质粒转化大肠杆菌DH5α中,涂布于含卡那霉素的LB琼脂培养基上,经双酶切鉴定后的阳性克隆送去测序.测序成功的重组质粒pET28a(+)-TRAP1转化大肠杆茵BL21 (DE3)中,在IPTG的诱导下,成功表达重组蛋白TRAP1.通过改变诱导温度、诱导时机、IPTG浓度及诱导时间,找出最佳表达条件,使重组蛋白TRAP1表达量最高.结果表明,在39℃条件下,0D600达到0.8时,经终浓度为0.1 mmol/L的IPTG诱导6h,目的蛋白的表达量最高.该研究为纯化出TRAP1蛋白,进一步研究该蛋白的结构和功能奠定了基础.     

人干细胞生长因子-α基因的克隆、表达及其协同rhGM-CSF对人脐带间充质干细胞的增殖作用

为了研究hSCGF-α对人脐带间充质干细胞 (Human umbilical cord mesenchymal stem cells,hUCMSCs) 的作用,采用基因工程技术获得重组人干细胞生长因子-α (Recombinant human Stem Cell Growth Factor-α,rhSCGF-α)。针对SCGF基因的高GC含量,采用PCR两步法获得hSCGF-α基因,插入pET-28a(+) 载体质粒,构建重组质粒pET-28a-SCGF-α,转化大肠杆菌BL21(DE3) 获得表达菌株。低温20 ℃诱导24 h,目标重组蛋白人干细胞生长因子-α以可溶性表达为主。通过Ni2+-NTA柱纯化,获得目标重组蛋白,电泳谱带扫描分析蛋白纯度可达90％以上。以巨噬细胞/粒细胞(Granulocyte/macrophage,GM)集落形成实验鉴定重组蛋白的生物学活性,并协同重组人巨噬细胞/粒细胞集落刺激因子(Recombinant human GM-colony stimulating factor,rhGM-CSF) 研究其对人脐带间充质干细胞的影响。结果显示,纯化的重组蛋白rhSCGF-α具有生物学活性;hSCGF-α及rhGM-CSF对hUCMSCs均有刺激增殖活性,但协同作用效果最强。