穿膜肽KGF-2的构建及其对HaCaT增殖作用的影响

目的:构建穿膜肽KGF-2(TAT-KGF-2),研究其对人角质形成细胞HaCaT的增殖作用。方法:采用普通PCR技术和特殊引物从人胚胎肺成纤维细胞cDNA中扩增出目的基因TAT-KGF-2,并将其插入pET-28a(+)载体中构建pET28a-TAT-KGF-2重组质粒;将该质粒转化大肠杆菌Rosetta(DE3),IPTG诱导表达重组蛋白TAT-KGF-2;通过Ni-NTA柱纯化获得目标重组蛋白并利用Western blot进行鉴定;MTT法研究TAT-KGF-2对HaCa的增殖作用。结果:成功构建pET28a-TAT-KGF-2重组质粒,经序列比对,与GenBank上公布的人KGF-2基因序列同源性达到100%;获得穿膜肽KGF-2蛋白,分子量约为19 kDa,纯度达到95%以上;TAT-KGF-2对HaCaT在12.5ng/ml时具有增殖作用,并呈浓度依赖性,而且与不具有穿膜功能的KGF-2相比有更强的增殖效果。结论:成功纯化出TAT-KGF-2蛋白,并验证其对HaCaT具有增殖作用,为进一步研究该蛋白的结构和功能奠定了基础。     

人干细胞生长因子-α基因的克隆、表达及其协同rhGM-CSF对人脐带间充质干细胞的增殖作用

为了研究hSCGF-α对人脐带间充质干细胞 (Human umbilical cord mesenchymal stem cells,hUCMSCs) 的作用,采用基因工程技术获得重组人干细胞生长因子-α (Recombinant human Stem Cell Growth Factor-α,rhSCGF-α)。针对SCGF基因的高GC含量,采用PCR两步法获得hSCGF-α基因,插入pET-28a(+) 载体质粒,构建重组质粒pET-28a-SCGF-α,转化大肠杆菌BL21(DE3) 获得表达菌株。低温20 ℃诱导24 h,目标重组蛋白人干细胞生长因子-α以可溶性表达为主。通过Ni2+-NTA柱纯化,获得目标重组蛋白,电泳谱带扫描分析蛋白纯度可达90％以上。以巨噬细胞/粒细胞(Granulocyte/macrophage,GM)集落形成实验鉴定重组蛋白的生物学活性,并协同重组人巨噬细胞/粒细胞集落刺激因子(Recombinant human GM-colony stimulating factor,rhGM-CSF) 研究其对人脐带间充质干细胞的影响。结果显示,纯化的重组蛋白rhSCGF-α具有生物学活性;hSCGF-α及rhGM-CSF对hUCMSCs均有刺激增殖活性,但协同作用效果最强。