拟南芥中柯浩体蛋白Atcoilin的克隆、表达及纯化

旨在制备柯浩体的标志蛋白——Atcoilin蛋白,利用pET-28a与目的基因构建重组表达质粒,经DNA测序证实插入序列与设计完全一致后,将重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),用IPTG进行诱导表达,产物用SDS-PAGE及Western blotting分析鉴定。通过分别改变IPTG的浓度、培养时间、培养温度等来优化Atcoilin蛋白的表达条件。表达出的重组蛋白经过镍柱、分子筛进行纯化。结果显示,原核表达载体pET28a-At1g13030成功构建,可在大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达,得到相应的重组蛋白经Western blotting鉴定正确。在IPTG浓度为0.7 mmol/L,18℃培养20 h的条件下,目的蛋白表达量最高。经过SDS-PAGE分析鉴定,过镍柱、分子筛后得到的重组蛋白纯度较高。     

猪抵抗素(resistin)表达载体的构建、表达及表达产物的纯化鉴定

用PCR方法扩增到抵抗素基因(RSTN)并将其亚克隆至pET-32a(+)表达载体,获得重组质粒pET-RSTN.将重组质粒转化大肠杆菌BL-21(DE3)感受态细胞,用IPTG诱导表达.SDS-PAGE检测结果表明,重组resistin蛋白分子量大小约30kDa.对表达条件如温度、IPTG浓度及诱导时间进行优化并用SDS-PAGE检测.结果表明,30℃、4h、IPTG浓度为1mmol/L时,可溶性重组resistin的含量最高.表达产物经Western blot检测证实是Resistin蛋白,并用镍离子亲和层析的方法获得纯化的Resistin蛋白.     

人IL-6基因的克隆及其在原核生物中表达及条件的优化

构建人白细胞介素6(IL-6)的原核表达载体并优化其表达条件,为IL-6的高效表达提供试验依据。以人T细胞cDNA为模板通过PCR方法扩增IL-6基因,将其克隆到原核表达载体pET28a(+)中,酶切及测序鉴定重组体。将构建好的重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),用IPTG进行诱导表达,产物用Western blotting及人IL-6检测试剂盒分析鉴定。在保持菌种不改变的前提下,分别改变IPTG的浓度、培养时间、卡那霉素浓度、培养温度等来优化IL-6表达条件。结果显示,原核表达载体pET28 a(+)-IL-6成功构建,可在大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达,得到相对分子质量约22 kD的IL-6蛋白,经Western blotting鉴定正确,经人IL-6试剂盒检测显示具有较高的免疫活性。在IPTG浓度400μmol/mL,卡那霉素浓度50μg/mL,40℃培养6 h的条件下,目的蛋白表达量最高,可占总蛋白表达量的40%。成功构建人IL-6原核表达载体且获高效表达,为研究IL-6生物学活性及产品开发提供了试验基础。     

哈氏弧菌谷胱甘肽还原酶基因克隆及原核表达

经克隆哈氏弧菌谷胱甘肽还原酶(GR)基因,并构建其原核表达载体,以获得相应的表达蛋白。将GR和p ET-32a(+)通过Bam H I和Xho I双酶切后,体外用T4连接酶连接,构建重组质粒p ET-GR;然后转化至大肠杆菌BL21(DE3)中,利用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,应用SDS-PAGE分析表达情况和表达条件。SDS-PAGE电泳获得分子量约为68.9 k D融合蛋白条带。在E.coli BL21(DE3)中重组质粒p ET-GR的表达条件为28℃,0.7 mmol/L的IPTG浓度诱导4 h表达量最高,且主要以包涵体形式表达。哈氏弧菌谷胱甘肽还原酶基因在大肠杆菌中获得了高效表达。     

热玫瑰小双孢菌来源的丙酮酸磷酸双激酶的表达及应用

以热玫瑰小双孢菌基因组DNA为模板, 通过PCR扩增得到了编码PPDK的基因, 将此基因片段插入到表达载体pET28a(+)中构建得到了重组表达质粒pET28a(+)-PPDK, 将重组表达质粒pET28a(+)-PPDK转化到大肠杆菌BL21(DE3)中, 经过IPTG诱导, 重组菌成功表达了N端带有6-His Tag的重组PPDK。经SDS-PAGE分析, 重组PPDK单体分子量为101 kD。经过镍亲和层析和超滤后, 重组PPDK蛋白基本达到电泳纯, 并被成功应用于焦测序中。     

热玫瑰小双孢菌来源的丙酮酸磷酸双激酶的表达及应用

以热玫瑰小双孢菌基因组DNA为模板, 通过PCR扩增得到了编码PPDK的基因, 将此基因片段插入到表达载体pET28a(+)中构建得到了重组表达质粒pET28a(+)-PPDK, 将重组表达质粒pET28a(+)-PPDK转化到大肠杆菌BL21(DE3)中, 经过IPTG诱导, 重组菌成功表达了N端带有6-His Tag的重组PPDK。经SDS-PAGE分析, 重组PPDK单体分子量为101 kD。经过镍亲和层析和超滤后, 重组PPDK蛋白基本达到电泳纯, 并被成功应用于焦测序中。     

猪抵抗素(resistin)的原核表达及表达产物的纯化鉴定

用PCR方法扩增到抵抗素基因(Resistin, RSTN)并将其亚克隆至pET-32a(+)表达载体,获得重组质粒pET-RSTN。将重组质粒转化大肠杆菌BL-21（DE3）感受态细胞,用IPTG诱导表达。SDS-PAGE检测结果表明,重组resistin蛋白分子量大小约30kDa。对表达条件如温度、IPTG浓度及诱导时间进行优化并用SDS-PAGE检测。结果表明,30℃、4h、IPTG浓度为1mmol/L时,可溶性重组resistin的含量最高。表达产物经Western blot检测证实是Resistin蛋白,并用镍离子亲和层析的方法获得纯化的Resistin蛋白。     

植原体免疫主导膜蛋白Imp基因原核表达载体构建及表达

旨在构建植原体免疫主导膜蛋白Imp基因原核表达载体,并进行初步表达。以重组克隆质粒pMD18-T-Imp为模板,PCR扩增Imp基因片段。构建表达载体pET-28a(+)-Imp,转化宿主菌E.coliBL21(DE3)。筛选阳性克隆,提取重组质粒作PCR鉴定、酶切鉴定及IPTG诱导表达鉴定。PCR及双酶切结果显示,重组质粒pET-28a(+)-Imp构建成功。经IPTG诱导BL21(pET-28a(+)-Imp)表达约20 kD的蛋白,与预期的携带6×His-Tag的目的蛋白(19.5 kD)大小相符,主要以包涵体形式存在。结果显示,构建的表达载体pET-28a(+)-Imp在E.coliBL21(DE3)中能够达一定量表达,为进一步纯化Imp蛋白奠定基础。     

建鲤leptin两种原核表达载体的构建和表达

使用SignalP-4.0软件预测信号肽剪切位点,设计引物扩增建鲤(Cyprinus carpio var.jian)leptin基因(jlLEP-A1,jlLEP-B)不含信号肽的ORF区域。扩增产物分别连接到pET-32a(+)和pGex-4T-1原核表达载体,构建重组质粒,测序验证插入位点的正确性。将重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导表达重组蛋白pET-32a(+)/jlLEP-A1,pET-32a(+)/jlLEP-B和pGex-4T-1/jlLEP-A1,pGex-4T-1/jlLEP-B。结果表明,在37℃和1 mmol/L IPTG的条件下诱导5 h,重组蛋白表达量最大。SDS-PAGE电泳显示重组蛋白主要以可溶蛋白形式存在。这一结果为后续的建鲤leptin基因功能研究奠定了基础。     

人抗酶抑制因子-1的克隆与原核表达

目的:克隆人抗酶抑制因子-1(ornithine decarboxylase antizyme inhibitor-1,OAZI-1)cDNA,建立在大肠杆菌中原核表达并纯化人OAZI-1蛋白的实验技术。方法:巢式RT-PCR法从人A549总RNA中扩增人OAZI-1 cDNA并构建pET-28a/OAZI-1原核表达质粒。该质粒转化大肠杆菌原核表达菌BL21(DE3)后IPTG诱导表达。诱导表达出的重组蛋白用Ni-NTA树脂亲和层析纯化。SDS-PAGE和Western法检测重组OAZI-1蛋白的表达和纯化。结果:成功克隆出编码全长人OAZI-1的cDNA序列,并构建出原核表达质粒pET-28a/OAZI-1。DNA测序分析,重组质粒中的OAZI-1 cDNA无突变,与6×His标签框架对接正确。重组质粒转化入大肠杆菌表达菌BL21(DE3)中后,可用IPTG诱导表达出重组OAZI-1蛋白,该重组蛋白可用Ni-NTA树脂亲和层析纯化。结论:成功建立了人抗酶抑制因子的原核表达和纯化的实验方法,为后续OAZI-1的功能研究奠定了基础。     

GnRH及其转运肽基因真核表达载体的构建及表达

目的 构建GnRH/TRS与绿色荧光蛋白(GFP)的融合基因并表达.方法 利用DNA重组技术,将GnRH/TRS片段克隆至真核表达载体pEGFP-C1转化DH5 α,重组体质粒pEGFP-C1-GnRH/TRS用LipoGen脂质体进行转染至Hela细胞,核酸序列测定和Western印迹分析基因表达,激光共聚焦荧光显微镜观察活细胞内荧光布局.结果 重组子pEGFP-C1-GnRH/TR成功构建.激光共聚焦荧光显微镜观察结果表明,GnRH/TKS-GFP融合基因的瞬间和稳定表达均获得了相同结果.结论 GnRH/TRS-GFP融合蛋白具有GFP的自发荧光特性,且不影响GnRH/TRS分子在细胞内的正确表达.     

HIV-1辅受体配体的融合表达载体的构建及表达

应用PCR扩增RANTES-KDEL基因,鉴定后与真核表达载体pCMV-S/K连接,构建成HIV-1辅受体的配体、趋化因子RANTES和SDF-1的融合表达载体pCMV-R-K-S-K,酶切鉴定和测序证明成功构建了pCMV-R-K-S-K融合表达载体.脂质体介导pCMV-R-K-S-K转染HeLa细胞,间接免疫荧光证实RANTES和SDF-1可高效表达于HeLa细胞.结果表明构建的pCMV-R-K-S-K融合表达载体能在HeLa细胞中高效表达,可用于下一步的HIV-1感染实验.     

HIV—1辅受体配体的融合表达载体的构建及表达

应用PCR扩增RANTES－KDEL基因,鉴定后与真核表达载体pCMV-S/K连接,构建成HIV－1辅受体的配体,趋化因子RANTES和SDF－1的融合表达载体pCMV-R-K-S-K,酶切鉴定和测序证明成功构建了pCMV-R-K-S-K融合表达载体。脂质体介导pCMV-R-K-S-K转染HeLa细胞,间接免疫荧光证实了RANTES和SDF－1可高效表达于HeLa细胞。细胞表明构建的pCMV-R-K-S-K融合表达载体能在HeLa细胞中高效表达,可用于下一步的HIV－1感染实验。     

鸡输卵管特异表达载体的构建及其体内表达

用高保真PCR法分别从中国狼山鸡基因组DNA中扩增出卵清蛋白基因(ov)的5′和3′调控区,将其克隆入pGEMT载体,经序列测定证明与已发表的ov基因相应区域无差异。将上述调控序列插入黏粒载体,构建成鸡输卵管特异表达载体pOV。再将lacZ报告基因克隆在上述载体5′调控区的下游,获得的重组载体命名为pOVlacZ。用脂质体包裹的pOVlacZ注射产蛋鸡,RTPCR检测结果表明lacZ基因仅在注射鸡输卵管的膨大部表达,不能在肝、脾、肾、心等组织表达。在上述组织中,仅输卵管膨大部能检测出β半乳糖苷酶活性(1167mUml),注射雌激素对报告基因的表达具有促进作用(1533mUml),重组酶能被分泌到鸡蛋的蛋清中(1733mUml)。结果表明,克隆的鸡ov基因调控区能有效驱动报告基因在输卵管的特异表达,构建的载体能用于鸡输卵管生物反应器的研制。     

HGF基因真核表达质粒的构建及其细胞表达

目的:构建真核表达质粒p EGFP-N1-HGF并观察干细胞生长因子(hepatocyte growth factor,HGF)在人皮肤成纤维中的表达。方法:从扩增人的间充质干细胞中提取全长RNA为模板,设计合成引物,用RT-PCR法扩增出HGF基因片段,然后将HGF基因片段连接于真核表达质粒p EGFP-N1中。双酶切鉴定及测序分析后,用脂质体包裹转染体外培养的人的皮肤成纤维细胞,通过荧光显微镜观察其转染效果,酶联免疫吸附测定法(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)检测HGF蛋白的表达。结果:经酶切鉴定及测序验证p EGFP-N1-HGF构建正确,经转染的人皮肤纤维细胞中观察到较强的绿色荧光并且可以表达一定量的HGF。结论:成功构建了真核表达质粒p EGFP-N1-HGF,为基因治疗脱发疾病提供实验基础。     

人IL-3基因原核表达载体的构建及表达

目的：构建人IL-3基因原核表达载体pET32a-IL-3,并在大肠杆菌中诱导表达。方法：通过佛波酯（TPA）和植物球血凝素（PHA）刺激人T淋巴细胞系Jurkat细胞,增加IL-3mRNA表达水平,提取mRNA,逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）获得cDNA,以Jurkat细胞cDNA为模板,通过PCR方法扩增得到人IL-3基因,将其克隆入原核表达载体pET32a（＋）中,将重组质粒转化入大肠杆菌宿主菌株BL21中,以异丙基硫代半乳糖苷（IPTG）诱导融合蛋白表达,并通过改变IPTG浓度,诱导时间,诱导温度等条件最终实现蛋白的可溶性表达。表达产物用SDS-PAGE检测表达情况。结果：酶切鉴定和测序结果证明成功构建了原核表达载体pET32a．IL-3。SDS-PAGE检测结果证明实现了人IL-3基因在大肠杆菌中的可溶性表达。结论：成功构建了人IL-3基因的原核表达载体并在大肠杆菌中获得了良好的表达。     

原核表达载体pET28a-EGFP的构建与表达

以质粒PEGFP-N3中增强型绿色荧光蛋白（Enhanced Green Fluorescent Protein,EGFP）基因片段为模板,利用PCR技术扩增得到EGFP基因片段,并设计引物在其2端引入酶切位点EcoRⅠ和HindⅢ,对引入酶切位点的EGFP片段和pET28a质粒进行双酶切处理后,利用T4连接酶连接得到了重组质粒pET28a-EGFP。利用热击法把得到的重组质粒pET28a-EGFP转化至E.coliBL21（Escherichia coliBL21）感受态细胞中,当大肠埃希菌LB（Luria-Bertani）培养液在600 nm下的光密度值OD600=0.4时,通过添加异丙基硫代β-D-半乳糖苷（IPTG）作为诱导剂诱导EGFP表达。结果表明：重组质粒酶切鉴定及测序结果正确。在自然光下,转化子在LB固体培养基（含1 mmol/L的IPTG和50μg/mL的卡那霉素（Kan））中菌落呈绿色。在荧光显微镜下受蓝光激发,可以清楚观察到发绿色荧光的转化子。成功构建的原核表达载体pET28a-EGFP在E.coliBL21中得到了高效表达,为以后作为荧光标记物标记食源性病原菌提供了一定的理论和技术支持。     

中国株HIV-1外膜蛋白真核表达载体的构建与表达

To construct the eukaryotic expression vector of HIV-1 gp120 gene and observe its expression in vitro, the recombinant expression vector pVAX1GP120 was constructed by inserting the gp120 gene into the eukaryotic expression vector pVAX1. The pVAX1GP120 was transfected into Vero cells by lipofectamine and the expressed product was detected by indirect immunofluore- scence.Restriction enzymes digestion analysis and sequencing results revealed that the recombinant expression vector pVAX1GP120 has been constructed successfully. The indirect immunofluorescence result showed green fluorescence on the membrane of transfected cells. The constructed eukaryotic expression vector of HIV-1 gp120 can be expressed in vitro, which lay the foundation for the further study of HIV-1 DNA vaccine.     

用于植物基因研究的mCherry表达载体构建及定位表达

荧光蛋白在生物学研究中具有广泛的应用和重要的作用,其中红色荧光蛋白mCherry因其颜色和良好的特性,对于植物基因研究具有重要的使用价值,本研究将mCherry基因构建到pBI121植物表达载体系统中,构建了pBI121MCS-mCherry载体。利用基因枪转化法转入洋葱表皮进行表达验证,显微镜观察结果显示整个洋葱细胞具有红色荧光,证明该载体能够在植物细胞中表达红色荧光蛋白。利用双酶切连接法将转录因子BpMYB4基因构建到该载体上,得到融合表达载体pBI121MCS-mCherry-BpMYB4,在洋葱表皮中表达,结果显示细胞核具有红色荧光,证明该载体能够准确表达融合蛋白,进行亚细胞定位。同时融合基因时不再需要中间载体,构建简便,引入的KpnⅠ酶切位点,增加了可选择性。因此该载体可用于植物基因表达定位及转基因植株筛选研究中,为今后的白桦基因组学研究提供了材料。     

中国株HIV-1外膜蛋白真核表达载体的构建与表达

获得性免疫缺陷综合征(Acquired immunode- ficiency syndrome,AIDS)是由人类免疫缺陷病毒(Human immunodeficiency virus,HIV)引起的世界广泛流行、严重危害人类健康的疾病.