海绵细菌B25W最佳产抗培养基及发酵条件的研究

从辽宁海域的繁茂膜海绵(Hymeniacidonperleve)中分离到1株解淀粉类芽孢杆菌(Paenibacillusamyloliquefaciens),定名为海绵细菌B25W。它产生的抗生素用白色念珠菌(Candidaalbicans)为指示菌,通过单因子和均匀设计实验,发现菌株最佳产抗摇瓶发酵培养基:玉米面0.34%,豆饼粉1.66%,葡萄糖0.1%,ZnSO40.04%,MgSO40.02%,KH2PO40.04%;发酵条件:种龄12h,接种量10%,发酵时间20h,初始pH6.0,250mL三角瓶内含25mL培养基,往复式摇床,116次/min,振幅11cm,培养温度28℃。应用二剂量法(以制霉菌素为标样)测定B25W抗生素的相对效价为13680u/mL,比优化前效价(8444u/mL)提高了62%。     

工业生产益生菌微囊化技术的研究进展

益生菌的微囊技术因其能显著提高益生菌的在胃肠道中的存活率而备受关注。本研究从益生菌微囊技术中所使用的包埋材料出发,深入论述了能应用于生产的微囊技术,并引出生产不同益生菌产品的常用技术。     

罗伊乳杆菌增殖培养基中碳源氮源的优化

目的提高罗伊乳杆菌的发酵活菌数,以提高发酵产率,降低生产成本。方法采用光电比浊法与活菌计数法,通过单因素试验和正交设计方法对罗伊乳杆菌的增殖培养基的碳源和氮源进行优化,并且绘制优化前后的生长曲线。结果罗伊乳杆菌增殖培养基中最佳的碳源、氮源种类与浓度为葡萄糖2.1%、蔗糖3.0%、牛肉膏1.5%、酵母粉1.4%,最佳的培养时间为10h。结论通过优化罗伊乳杆菌的增殖培养基,提高了发酵产率,降低了生产成本。     

Red体内同源重组介导的egfp、kan基因融合和重组质粒构建

重组工程是近年来建立的一种基于高效率体内同源重组的新型遗传工程技术,可应用于靶DNA序列的敲入、敲除和基因克隆等。在应用重组工程技术进行基因亚克隆时发现,体外重叠PCR法难以获得高质量的目的DNA打靶片段,严重影响重组效率。为了解决上述问题,根据Red重组酶介导的体内同源重组工作原理进行了技术改进。先用PCR方法合成egfp和kan两条末端互补的线性DNA片段,然后将其电击共转化进入携带Red重组酶和pcDNA3.1载体DNA的大肠杆菌DY331菌株内,经体内同源重组直接产生的pcDNA3.1-egfp-kan环状重组质粒DNA分子可通过抗生素标记筛选获得,阳性率可达到45%,瞬时转染pcDNA3.1-egfp-kan可获得绿色荧光蛋白在293细胞中的表达。     

生长激素释放激素和人血清白蛋白融合蛋白的克隆表达

目的:通过与人血清白蛋白(HSA)融合,延长生长激素释放激素(GHRH)在体内的半衰期。方法:根据毕赤酵母偏爱密码子重新设计GHRH的核酸序列,并通过化学合成和重叠PCR法将GHRH的N端与HSA的C端通过一个11肽的接头连接,获得GHRH和HSA融合的全长基因序列。构建pPIC9-HSA-GHRH表达载体,电击转化毕赤酵母GS115感受态细胞,通过表型筛选和诱导表达实验得到蛋白表达工程菌,对表达产物进行分离纯化和生物学活性分析。结果:克隆了HSA-GHRH融合基因,构建了pPIC9-HSA-GHRH融合表达载体;电击转化后通过表型筛选和诱导表达实验得到蛋白表达工程菌;经分离纯化后,对表达产物的生物学活性分析显示其在体内有促进生长的作用。结论:与人血清白蛋白的融合有效地提高了GHRH的表达水平,并延长了GHRH的半衰期。     

利用HER2/neu胞外配体结合区2从噬菌体抗体库中筛选抗体及其初步鉴定

目的:利用HER2/neu胞外配体结合区2(RLD2)从噬菌体抗体库中筛选相应抗体,并进行初步检测。方法:设计合成引物,利用PCR方法克隆出RLD2基因后,将其连接到pET-24a( )载体中,在大肠杆菌中实现高效表达。对包涵体蛋白经纯化、透析复性后得到目的蛋白。以得到的目的蛋白为靶标,从人源性噬菌体抗体库中进行4轮筛选得到抗体,经ELISA法初步鉴定,并用MTT法检测阳性克隆。结果与结论:初步得到6株亲和力较高的抗HER2/neu抗体,选取其中2株进行了MTT法检测,表明对HER2高表达的乳腺癌细胞有较明显的抑制作用。     

腺相关病毒介导的RNA干扰抑制HeLa细胞中CTCF的表达

目的:利用RNA干扰(RNAi)稳定抑制HeLa细胞中CTCF的表达。方法:构建能够抑制转录因子CTCF表达的短发夹RNA(shRNA)的腺相关病毒载体,重组病毒感染HeLa细胞后挑取单克隆,用Western印迹法和实时荧光定量PCR检测CTCF的表达水平。结果:获得3株CTCF被显著抑制的HeLa细胞株,Western印迹法和实时荧光定量PCR结果均显示CTCF的表达水平被抑制,其中最明显的被下调76%。结论:shRNA病毒表达载体构建成功,HeLa细胞中CTCF的表达可被长期稳定地抑制。     

寨卡病毒囊膜E蛋白的原核表达及其抗体制备

目的:在大肠杆菌BL21(DE3)中重组表达寨卡病毒(ZIKV)囊膜(E)蛋白的200个氨基酸(138～338)截短片段ZIKV-E~(200),制备其多克隆抗体,为寨卡病毒亚单位疫苗后续研究提供检测抗体。方法:用全基因序列合成方法合成寨卡病毒E蛋白全长基因,以该基因为模板,用PCR方法克隆ZIKV-E~(200)基因片段,经EcoRⅠ/XhoⅠ双酶切后连接到pET22b载体并转化大肠杆菌DH5α感受态细胞,获得重组质粒pET22b-ZIKV-E~(200),将其转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞得到重组表达菌株pET22b-ZIKV-E~(200)。将37℃诱导表达后的菌液超声波破碎处理后制备ZIKV-E~(200)蛋白,将制备的抗原ZIKV-E~(200)免疫BALB/c小鼠,经3次免疫后,采集血清制备其相应的多克隆抗体,采用Western印迹检测多克隆抗体的特异性。结果:获得ZIKV-E~(200)基因片段,并构建了其相应的原核表达载体pET22b-ZIKV-E~(200),在大肠杆菌中表达了重组ZIKV-E~(200)蛋白,其相对分子质量约为25 000,与理论值一致;用分离的蛋白ZIKV-E~(200)免疫小鼠后获得了抗ZIKV-E蛋白的多克隆抗体,该多克隆抗体检测到了酵母表达的寨卡病毒E蛋白。结论:ZIKV-E~(200)蛋白的多克隆抗体可用于酵母表达的寨卡病毒E蛋白的检测等研究。     

益生菌的应用现状和发展前景

益生菌,是一类被科学家证实为对人体和动物体有益的菌。目前,已被广泛运用于医药、食品、畜牧业等多个领域。益生菌的产品诞生于20世纪30年代,经历了将近一个世纪的发展后,在国外已形成一个完整的产业链和成熟的市场。但在我国,则处于一个刚起步的阶段。可能国内的人们对益生菌的产品有点陌生,但随着人们生活水平的提高和消费观念的转变,他们对食品的要求已不再单纯停留在解决温饱的问题上,而是更多地追求安全、健康和营养。相信只要加大对益生菌产品的宣传和消费引导,益生菌在国内亦将有一片广阔的发展前景。     

甲基营养菌甲醇脱氢酶基因的克隆及表达

目的:从甲基营养菌MP681中扩增甲醇脱氢酶(MDH)基因,在大肠杆菌中表达并检测其活性,同时在MP681中考察该基因对吡咯喹啉醌(PQQ)产生的影响。方法:根据MP681基因组序列设计引物,PCR扩增靶基因mdh,构建表达载体,考察活性,利用接合转移转化至MP681,考察PQQ的合成。结果:扩增得到甲基营养菌MP681甲醇脱氢酶基因,在大肠杆菌中的表达产物能够催化甲醇脱氢;将携带mdh基因的质粒转入MP681后,PQQ产量略有提高。结论:获得编码MDH的基因,该基因能够在大肠杆菌中表达,且表达产物具有生物活性;甲醇脱氢酶基因表达对宿主菌的PQQ合成可能有一定影响。