青藏高原牦牛遗传资源保护和利用:问题与展望

牦牛是青藏高原牧民生产生活中必不可少的特有家畜,对青藏高原区域经济发展与生态文明建设具有不可替代的重要意义。近年来,随着牦牛饲养数量增加,草地退化程度加剧,牦牛生产性能也在不断下降,青藏高原原有的土-草-畜循环和草畜平衡被打破,影响了青藏高原生态系统的协调、稳定发展。本文从牦牛的分布区域、数量变化、品种分类、品种退化、品种改良、基因组研究进展、问题对策与展望等方面,综合阐述了近年来我国牦牛遗传资源保护与开发利用的相关研究进展,为今后的牦牛科研工作和生产实践提供参考。     

北部湾涠洲岛水域发现上颌和须板异常的布氏鲸:对保护的启示

2018年初以来,北部湾涠洲岛附近出现了布氏鲸（Balaenoptera edeni）的活动。一头上颌与须板异常的小布氏鲸个体引发热议,其视频在网络上广泛流传。我们在船只调查时,目击该个体10次,其以单独活动为主（90%）,主要出现在涠洲岛到斜阳岛之间的水域,最小凸多边形家域面积为14km2,核心家域面积为166.9km²。然而,在 2019年3月30日我们发现该个体已死亡漂浮在海面,根据尸体腐烂状况来推测,该个体的死亡时间大约为3~5日,死亡原因不明。根据照片和现场解剖分析,推测该小布氏鲸的上颌和鲸须异常可能是被渔网或绳索缠绕导致的。由于无法从外形上确认属于哪一个亚种,因此我们测定了该个体的线粒体DNA D-loop（mitochondrial DNA, mtDNA）和细胞色素b（cytochrome b, Cyt b）基因,分别得到909bp和395bp的序列,经比对和系统发育重建,发现该个体属于近岸分布的小布氏鲸亚种（Eden’s whale, B. e. edeni）。由于小布氏鲸具有一定季节迁移特性,我们无法判断造成其上颌伤害的渔网或绳索是否在中国水域。尽管如此,仍然建议当地部门应加强宣传,减少渔网等海洋垃圾的丢弃和排放,为小布氏鲸营造一个安全的栖息环境。     

番茄转录因子基因SlWRKY6的克隆与原核表达分析

该研究基于番茄基因组数据库SGN(Sol Genomic Network)信息,利用RT PCR从栽培番茄‘M82’(Solanum lycopersicum)中成功克隆到番茄SlWRKY6基因(登录号：Solyc02g080890),通过qRT PCR方法和原核表达初步验证其生物学功能。结果表明：(1)生物信息学分析显示,番茄SlWRKY6基因ORF全长1 653 bp,编码550个氨基酸,其蛋白结构含有1个WRKYGQK保守结构域和C₂H₂锌指结构域,属于IIb类;其基因启动子上游1 500 bp含有多个激素响应元件和非生物胁迫响应元件。(2)进化树分析显示,SlWRKY6与潘那利番茄SpWRKY31 X1(NP_001352691.1)的相似性最高,且定位于细胞核内。(3)qRT PCR结果显示,SlWRKY6基因在番茄根、茎、叶中均有表达,在叶中的表达量最高,且受盐和干旱诱导表达。(4)SDS PAGE及Western blot结果显示,pET 30a SlWRKY6重组蛋白的大小约66 kDa,与预期大小一致。(5)原核表达分析显示,重组菌E. coli BL21∷pET 30a SlWRKY6在不同浓度盐(NaCl)和干旱(Mannitol)胁迫下生长速度显著低于对照菌E. coli BL21∷pET 30a,且在400 mmol/L NaCl、800 mmol/L甘露醇胁迫条件下最为显著;滴板实验初步验证SlWRKY6转录因子能提高重组菌E. coli BL21∷pET 30a SlWRKY6在ABA和pH 9(NaOH)胁迫的耐受性;在400 mmol/L NaCl、pH 5(HCl)、800 mmol/L甘露醇胁迫条件下耐受能力降低。研究表明,SlWRKY6转录因子可能通过参与ABA途径来响应非生物胁迫。     

甘菊3个ClSCL6基因的克隆及表达分析

GRAS家族HAM亚家族基因是维持植物茎端分生组织(shoot apical meristem,SAM)未分化状态的重要因子,并影响着植物的成花转化进程。该研究基于转录组数据中甘菊(Chrysanthemum lavandulifolium)HAM亚家族基因同源序列设计引物,利用RT PCR技术从甘菊中克隆得到3个HAM类基因。序列分析结果表明,所克隆的3个基因开放阅读框长度分别为1 845、1 479和1 881 bp,分别编码614、492和626个氨基酸。Blastp分析显示,3个基因的编码蛋白均含有典型HAM亚家族蛋白特征,并与菊科植物黄花蒿(Artemisia annua)SCL6蛋白具有较高的一致性,分别达到了94.39%、91.90%和94.27%。进一步分析表明,3个基因的编码蛋白与所有拟南芥GRAS家族中的SCL6蛋白进化关系最近,故将其分别命名为ClSCL6a、ClSCL6b和ClSCL6c。荧光定量分析显示,3个ClSCL6基因均在甘菊茎中表达量最高,而在根和花中表达量普遍较低。在不同发育时期的花器官中,3个ClSCL6基因均有表达,其中ClSCL6a在管状花花粉散开前达到表达高峰,ClSCL6b和ClSCL6c则在小花蕾时期表达量最高,在其他时期表达水平差异不大。该研究结果为进一步研究ClSCL6在菊花成花转化过程中的功能奠定了基础。     

文心兰COL基因的分离及其表达分析

CONSTANS(CO)及CONSTANS-like(COL)基因在光周期调控植物开花中起到重要的作用。该研究以文心兰(Oncidium)品种‘金辉’为材料,分离了CO同源基因OnCOL2及另外2个COL基因(OnCOL8和OnCOL9),它们分别编码326、411和291个氨基酸;生物信息分析预测它们均定位于细胞核;OnCOL2、OnCOL8有2个锌指B-box结构域和1个CCT结构域,而OnCOL9缺少B-box结构域。多序列比对及进化树分析结果表明,所有COL蛋白可划分为3组,OnCOL2与OnCOL8、OnCOL9分到了2个不同组中。OnCOL2与建兰(Cymbidium ensifolium)CeCOL(90.77%)高度相似;OnCOL8与OnCOL9在进化关系上更为接近,分别与拟南芥(Arabidopsis thaliana)AtCOL9和AtCOL10关系最近,它们在B-box和CCT结构域都极为保守。表达分析结果表明OnCOL2、OnCOL8与OnCOL9分别在花、根和假鳞茎中表达量最高,在叶片中的表达呈周期性变化趋势,且在长、短日照条件下表达的峰值及时间均存在差异,在花芽分化时期的叶片中表达量均显著上调。研究表明,OnCOL2、OnCOL8与OnCOL9基因均受到生物钟和日长调节,在光周期途径中,可能通过上调它们的表达以促进文心兰花芽的形成。该研究结果为进一步研究基因功能及光周期调控文心兰开花机制奠定了基础。     

基于BSA-seq法的油菜野芥胞质雄性不育恢复基因的分析

细胞质雄性不育是利用杂种优势创制油菜杂交种的重要途径之一。而恢复系的选育及恢复基因的研究有利于提高细胞质雄性不育系的应用价值。该研究以甘蓝型油菜细胞质雄性不育系1193A和恢复系15-R1为亲本,以F_2群体构建了2个极端性状混池,采用BSA-seq技术方法,对恢复基因进行定位分析。结果表明:(1)不育系1193A与恢复系15-R1之间共获得非同义突变的SNPs共33 883个,混池间共有7 996个非同义编码突变。(2)InDel检测与注释结果表明,亲本间引起移码突变的有2 918个,混池间引起移码突变的有840个。(3)综合SNP和InDel的关联分析结果,将恢复基因定位于C09染色体上的0～880000区域,总长度为880 kb。(4)对候选区域的SNP和InDel注释发现,亲本间存在非同义突变的SNP共40个,混池间存在非同义突变的SNP共65个,亲本间存在移码突变的InDel共7个,混池间存在移码突变的InDel共11个;对候选区间内的编码基因进行注释,结果共注释到162个基因,其中存在非同义突变基因11个,移码突变基因5个,这些基因可能与育性恢复有关。     

小麦TaWRKYⅢ-A37和TaWRKYⅡc-D2基因的克隆与表达分析

为了探究小麦(Triticum aestivum L.)WRKY基因的功能,采用同源克隆的方法,从小麦品种‘科农199’中克隆得到2个WRKY基因,分别命名为TaWRKYⅢ-A37和TaWRKYⅡc-D2,并对其进行生物信息学分析和不同逆境胁迫下的表达分析。生物信息学分析显示,TaWRKYⅢ-A37和TaWRKYⅡc-D2基因都含有2个内含子和3个外显子,分别编码206和138个氨基酸,编码蛋白都属于亲水性不稳定非分泌型的核蛋白。系统进化分析表明,TaWRKYⅢ-A37蛋白与其两个同源拷贝的亲缘关系最近,而TaWRKYⅡc-D2蛋白与粗山羊草亲缘关系最近。qRT-PCR结果表明,TaWRKYⅢ-A37和TaWRKYⅡc-D2基因在小麦根、茎和叶中均有表达,前者在根中表达量最高,后者在叶中表达量最高,二者均在茎中低表达;在苗期TaWRKYⅢ-A37基因受到PEG、H_2O_2和ABA胁迫后表达上调,NaCl处理后4～8 h内表达下调且低于对照表达水平,而且在灌浆期受到PEG、NaCl、H_2O_2和ABA胁迫后表达均上调;苗期TaWRKYⅡc-D2基因在NaCl、H_2O_2和ABA胁迫后表达下调,PEG处理2 h时表达上调且高于对照表达水平,并且在灌浆期经PEG和NaCl胁迫后表达下调,受H_2O_2和ABA胁迫后表达上调。该研究结果为深入探究TaWRKYⅢ-A37和TaWRKYⅡc-D2基因的抗逆功能奠定了理论基础。     

‘741杨’D2类细胞周期蛋白基因的克隆及功能鉴定

D类细胞周期蛋白(D-type cyclin,CYCD)调控细胞周期G1/S期转变。CYCD与细胞周期蛋白依赖性激酶(cyclin-dependent kinase,CDK)结合形成CYCD/CDK复合物,被激活的CYCD/CDK复合物通过磷酸化下游细胞周期响应因子调控细胞周期有序进行,进而影响植物的生长发育。该研究以‘741杨’为实验材料,成功鉴定得到1个D2类细胞周期蛋白基因(PtoCYCD2;1)。研究表明:(1)实时定量PCR(qRT-PCR)显示,PtoCYCD2;1基因在根、茎、叶、叶柄、树皮和木质部中均有表达,在叶中的相对表达水平最高。(2)亚细胞定位表明PtoCYCD2;1蛋白定位于细胞核。(3)与野生型(Wild-Type poplar,WT)相比,过表达PtoCYCD2;1基因的‘741杨’出现株高降低,茎直径减小,叶片明显下卷的表型。(4)扫描电镜分析(SEM)显示,转基因杨树叶片的上表皮细胞平均面积变小,细胞数量增多;树脂切片结果显示与WT相比,转基因杨树叶片的栅栏组织和海绵组织的细胞间隙疏松。(5)qRT-PCR结果显示,转基因杨树中细胞周期调控基因CDKA;1、CDKB1;1和CDKB2;1的表达水平显著上调,植物成视网膜细胞瘤相关蛋白1(retinoblastoma-related protein1,RBR1)基因、细胞周期蛋白依赖性激酶抑制因子(kip-related protein,KRP)基因的表达水平显著下调。该研究结果为进一步研究木本植物CYCD2基因的功能奠定了基础。     

地涌金莲MlCCD8b基因的克隆与表达分析

该研究以地涌金莲(黄色苞片型YN01和红色苞片型RD05)为材料,采用RACE技术克隆获得地涌金莲CCD8b基因的cDNA全长,进行氨基酸序列比对及系统进化树构建,并采用实时荧光定量PCR技术检测MlCCD8b基因在不同地涌金莲类型和不同组织中的表达模式。结果表明：(1)序列分析显示,MlCCD8b的ORF全长1 671 bp,编码556个氨基酸,存在1个类胡萝卜素加氧酶家族的典型保守结构域RPE65,推测其相对分子量为61 574.26 Da,等电点6.61,亚细胞定位于叶绿体基质中的类囊体上,所编码的MlCCD8b蛋白为亲水性蛋白。(2)同源对比分析及构建系统进化树发现,地涌金莲MlCCD8b蛋白与小果野蕉亚种、凤梨等单子叶植物的CCD8b蛋白遗传关系最近。(3)荧光定量PCR检测结果表明,MlCCD8b在吸芽数量多的黄色苞片型YN01的所有组织中均有表达,而在吸芽数量少的红色苞片型RD05中,其苞片内未能检测到MlCCD8b的表达,但其他组织中皆有表达;MlCCD8b在2种类型地涌金莲中呈现一致的组织表达特异性,即在花序轴中的表达量最高,其次是吸芽芽点、根尖和叶片,在苞片中的表达量最低或不表达。(4)2种类型地涌金莲同一组织部位比较结果显示,RD05的花序轴、吸芽芽点、根尖和叶片中的MlCCD8b相对表达量分别是YN01的4.47、4.67、2.09和1.10倍。(5)利用高效液相色谱 串联质谱法测得RD05根尖部位的5 脱氧独脚金醇含量是YN01的15.57倍,与MlCCD8b在根尖的表达趋势一致。研究认为,MlCCD8b基因可能通过调控独角金内酯的合成,促进或抑制地涌金莲吸芽的萌生。该研究结果可为MlCCD8b基因的生物学功能研究提供依据,并为今后通过分子辅助育种调控MlCCD8b的表达,从而控制地涌金莲吸芽数量提供理论支持。