猪SOCS-2基因的克隆及序列分析

从中国地方猪品种八眉猪（BaMei）肾脏组织中提取总RNA,采用RT-PCR方法克隆了猪SOCS-2(suppressor of cytokine signaling -2,细胞因子信号转导抑制因子-2)基因的cDNA序列,经T/A克隆,插入到pMD19-T载体上,导入大肠杆菌DH-5α,阳性克隆经PCR鉴定后进行测序,将测序结果与GenBank中已登录的人、大鼠和小鼠SOCS-2基因的序列进行同源性比较,利用生物信息学和分子生物学软件对猪SOCS-2基因编码的蛋白进行结构预测。结果表明：首次成功克隆了猪SOCS-2基因的cDNA序列（GenBank登录号为EF121242）,其长度为822 bp,该基因ORF区核苷酸序列与其他物种相比同源性达到93%以上,氨基酸同源性则达到89%以上,生物信息学分析表明该蛋白分子量为22.25kD,等电点pI=8.30,包含199个氨基酸残基。该基因cDNA序列的克隆,有利于进一步研究SOCS-2调节机体发育的分子机理。     

稻瘟菌突变体T-DNA插入位点的精细定位和插入模式的研究

随机挑取已构建的37个稻瘟菌T-DNA突变株,利用TAIL-PCR技术扩增出T-DNA插入位点的侧翼序列,测序并进行比对分析。结果显示:成功获得扩增产物并测序的序列共有39条,T-DNA边界序列为稻瘟菌序列的有19条,其余20条为载体主干序列。在这有效扩增为稻瘟菌序列的19条中,有10条是T-DNA右侧翼序列与稻瘟菌序列,9条为左侧翼序列加稻瘟菌序列。分析T-DNA剪切位点,10条右侧翼序列中有9条的剪切位点相同,这与农杆菌介导T-DNA转化植物一样。而左边界的剪切位点就没有这种规律性。研究也精细确定了17个不同突变株的T-DNA插入位置,为后续的基因功能研究奠定基础。     

滇产与日产松茸的IGS1-RFLP比较分析

应用Cfr13I限制性内切酶对采自于云南省16个市县的127个松茸子实体进行了IGS1-RFLP比较分析,发现126个松茸子实体属于A类型,来自大理白族自治州剑川县的1例(TF89)为C类型。通过对A类型的IGS1序列分析发现产自云南的松茸有一个CTTT的简单重复,滇产松茸IGS1序列差异不明显。滇产松茸的IGS1-RFLP与日产松茸的主要类型十分相似,两地松茸可能是同源的。     

家蚕丝蛋白Fhx/P25基因启动子区域的克隆及序列分析

为研究家蚕Fhx/P25基因在时空上的调控机制,通过PCR扩增获得家蚕丝素蛋白Fhx/P25基因的启动子序列并进行克隆和序列分析。进一步构建了由Fhx/P25启动子驱动报告基因DsRed的表达载体pSK-P25-DsRed-PolyA,并通过家蚕BmN细胞进行瞬时表达。结果显示:Fhx/P25基因的启动子序列符合真核生物启动子特点,具有丝腺特异性表达启动子的特征,TATA框的保守序列为TATAA,位于-28—-32处,CAAT基序有3个,其中-110—-117和-90—-87处的2个CAAT基序可能具有活性;二级结构分析显示:Fhx/P25启动子区域具有复杂的茎环结构,这可能与蛋白表达的组织特异性、时间性以及活性有关。基因启动子可以驱动红色荧光基因DsRed在家蚕BmN培养细胞中的瞬时表达。     

基于线粒体COI基因探讨鹟亚科部分属和种的分类地位

采用PCR扩增、测序的方法,对鹟亚科（Muscicapinae）6属16种鸟类的线粒体COI基因序列1176 bp进行测定,并以荒漠伯劳和发冠卷尾作为外群构建Bayes、ML、MP 3棵系统发育树。结果支持：寿带属（Terpsiphone）、扇尾鹟属（Rhipidura）、方尾鹟属（Culicicapa）3属与鹟亚科其他鸟类亲缘关系较远,扇尾鹟属与方尾鹟属亲缘关系较近;鹟属（Muscicapa）为单系发生,本研究结果未能确定它与仙鹟属、姬鹟属的进化关系;铜蓝鹟（Muscicapa thalassina）从鹟属中移出,归入仙鹟属。上述结论解决了鹟亚科部分属间的进化关系,为鹟亚科分类系统的研究提供了分子水平证据。     

抗香蕉枯萎病的野生蕉抗病基因类似序列的克隆与表达

野生蕉是香蕉遗传改良的天然基因库。为了分离野生蕉中的抗病基因类似序列,根据核苷酸结合位点（nucleotide binding site,NBS）和丝氨酸,苏氨酸蛋白激酶域设计简并性引物,以经过鉴定的抗香蕉枯萎病4号生理小种的野生蕉（Musaacuminata）叶片cDNA为模板进行PCR扩增。经过对扩增产物进行克隆和测序,获得了6个500bp左右的RGAs片段。其中有2个RGA（WNB1和WNB2）具有NB—ARC保守结构域特征,并且WNB1具有连续的ORF。其余4个RGAs（WST1、WST2、WST3和WST4）均具有丝氨酸,苏氨酸蛋白激酶域特征,且WST3编码的氨基酸序列与水稻抗叶斑病基因Xa21同源性很高。用半定量PCR分析枯萎病菌诱导后野生蕉叶片中RGAs的表达情况,结果表明WNB1和WST3受枯萎病菌诱导后表达量增强,这表明wNB1和WST3的表达可能与香蕉枯萎病抗性相关。     

基于BAC重组酶系统构建莱航鸡多位点基因打靶载体的研究

以莱航鸡重复的rDNA基因间的间隔序列为靶位点,利用BAC重组酶系统构建含人干扰素基因的多位点基因打靶载体,为建立莱航鸡多位点基因打靶技术获得关键材料。首先构建BAC-TDN筛选载体,然后构建pYLVS-GID表达载体。将BAC-TDN筛选载体和pYLVS-GID表达载体共转化至大肠杆菌NS3529中,通过其Cre重组酶的作用形成BAC-TDN-VS-GID质粒,采用归位内切酶I-SceⅠ切除pYLVS质粒骨架,利用接头LS使之环化,构建成莱航鸡大容量多位点基因打靶载体BAC-TDN-GID。每次克隆均经酶切或PCR、测序等鉴定DNA片段的插入及插入方向。以该载体为材料的多位点基因打靶技术将提高基因定点整合效率,解决外源基因不能稳定表达、安全性等部分问题,突破了DNA重复序列不能作为外源基因整合靶位点的禁区。     

核酸、氨基酸分类和蛋白质二级结构关系的分析与分子设计

核酸序列中包含一定的蛋白质结构信息。根据通常情况下遗传密码表中密码子中间位的碱基配对时产生的氢键数目,尝试将20种氨基酸划分为两类,并用自编的计算机软件对蛋白质二级结构数据库中两类氨基酸的类聚现象进行了统计分析。结果表明,使用这种方法对氨基酸进行划分后,氨基酸残基具有较大概率与划入同一类的氨基酸残基相邻出现,并且这种聚集体对二级结构具有一定的偏好性。最后按照该方法设计了一段氨基酸序列并给出了预测服务器预测得到的结构。     

小麦种子中几丁质酶基因的扩增及序列分析

根据http://www.tigr.org中与小麦几丁质酶基因相关的序列TC187877,设计引物,分别从小麦品种Gamenya和苏麦3号中扩增到大小约为1 000bp的片段。经序列测定和软件分析比较,发现这些片段所编码的蛋白质氨基酸序列,都有CHITINASE-19.1和CHITINASE-19.2的基序,为第II类几丁质酶基因。扩增的核酸序列在GenBank上发表,登录号分别为AY973229和AY973230。     

基于分组重量编码的蛋白质功能预测

从蛋白质序列出发,采用分组重量编码(Encoding Based on Grouped Weight,简记EBGW),并结合最近邻居算法对蛋白质功能进行预测。对酵母(Saccharomyces cerevisiae)蛋白质的1826条序列进行预测,整体预测准确率与其他基于序列信息的蛋白质功能预测方法相当。实验结果表明基于EBGW编码方案的新方法可有效地应用于蛋白质功能预测。