TNF-α通过ERK和MAPK信号途径抑制猪骨骼肌成肌细胞分化

研究肿瘤坏死因子α(TNFα-)对猪骨骼肌成肌细胞分化的影响,并探讨其可能的作用机制。原代培养猪骨骼肌成肌细胞,通过倒置显微镜定性观察细胞分化的形态学变化;生肌指数和肌酸激酶(CK)活性定量分析成肌细胞分化程度;细胞免疫化学法分析肌球蛋白重链(MyHC)的蛋白表达情况;采用特异性抑制剂探讨TNFα-可能的作用信号途径。结果显示:在猪骨骼肌成肌细胞分化过程中,外源性TNFα-减少细胞核融合和肌管形成;浓度依赖性地显著降低生肌指数和CK活性(P<0.05);并显著抑制MyHC蛋白表达(P<0.05);TNFα- SB205380或TNFα- PD98059处理组与TNFα-处理组相比,其CK活性和myogenin蛋白表达显著回升(P<0.05)。结果表明:TNFα-抑制猪骨骼肌成肌细胞分化,并且这种作用可能是通过激活细胞外信号调节激酶(ERK)和促分裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号转导通路实现的。研究结果暗示TNFα-在猪骨骼肌成肌细胞分化过程中可能具有重要作用。     

实时荧光定量检测中国实验用小型猪肝脏CYP3A29 mRNA表达水平

CYP3A29是猪肝脏最重要的药物代谢关键酶。研究中国实验用小型猪肝脏CYP3A29 mRNA的表达特性对于评估其是否适宜于作为人CYP3A4介导的药理学研究动物模型具有一定意义。以b-actin作校正, 利用TaqMan定量技术对巴马香猪、贵州小型香猪肝脏CYP3A29 mRNA表达水平进行检测, 并以荣昌猪作为对照。结果表明, 巴马香猪、贵州小型香猪、荣昌猪肝脏CYP3A29 mRNA表达水平与报道的人肝脏CYP3A4相近; 三品系(种)猪间肝脏CYP3A29 mRNA表达水平较为接近, 但品系(种)内个体间变异较大。提示巴马香猪、贵州小型香猪作为药物评价的实验动物具有一定可行性。     

山东部分地方猪种MyoG基因5'端遗传多态性及遗传效应分析

采用PCR-SSCP方法对莱芜猪、大蒲莲猪、沂蒙黑猪和里岔黑猪的肌细胞生成素(myogenin,MyoG)基因5'端进行单核苷酸多态性检测,并分析MyoG基因对猪的初生重、60日龄重、210日龄重,60～210日龄平均日增重和背膘厚的影响。根据猪MyoG基因5'端的DNA序列(U14331)设计3对引物,发现5-2引物对扩增的片段有多态性,且存在3种基因型(AA、AB、BB),并对纯合子进行测序,发现2080位G→A突变。χ2独立性检验表明,基因型频率在莱芜猪和大蒲莲猪与沂蒙黑猪和里岔黑猪间存在显著差异(P<0.05)。固定效应模型分析结果表明,初生重基因型间差异显著(P<0.05),而60日龄重、210日龄重、60～210日龄平均日增重和背膘厚基因型间差异不显著(P>0.05)。最小二乘分析结果表明,BB基因型与其他两种基因型比较有较小的初生重和日增重,同AA和AB基因型比较差异极显著(P<0.01),3种基因型在初生重和60～210日龄日增重的大小排列顺序一致,为AA>AB>BB。因此,推测基因型对个体的初生重和日增重存在一定的影响,选择带有A等位基因的个体有望提高个体的初生重和日增重。     

小型表栖节肢动物群落对高寒湿地退化的响应

为查明小型表栖节肢动物群落对高寒湿地退化的响应,2014年7月和9月利用吸虫器法对若尔盖高寒湿地的沼泽草甸、草原草甸、中度退化草甸3种生境的小型表栖节肢动物群落进行调查。结果为:共采集到小型表栖节肢动物18661只,隶属于3纲15目85类(科或属),优势类群为球圆跳属(Sphaeridia)、长跳属(Entomobrya)和莓螨科(Rhagidiidae),其中长跳属仅出现在草原草甸。小型表栖节肢动物群落结构在不同生境间差异明显,主成分分析(PCA)结果表明影响群落结构的主要类群是长跳属(Entomobrya)、球圆跳属(Sphaeridia)、齿步甲螨属(Odontocepheus)、瘤蚜科(Pemphigidae)和叶蝉科(Jassidae),但不同月份间存在差异。小型表栖节肢动物的群落密度及类群数均以草原草甸最高,中度退化草甸最低,3种生境间有显著差异(P0.01)。3种生境的小型表栖节肢动物群落密度均是7月显著低于9月(P0.01),Shannon-Wiener指数和Simpson优势度指数则是7月显著高于9月(P0.01);类群数在沼泽草甸中7月显著低于9月(P0.05),在草原草甸和中度退化草甸则是7月显著高于9月(P0.05)。典范对应分析(CCA)及多元回归分析结果表明植物种类、生物量、土壤有机质含量是影响小型表栖节肢动物群落组成结构、密度及多样性的主要因子。研究结果表明高寒湿地退化能够显著影响小型表栖节肢动物群落的组成结构、密度和多样性及其季节动态。     

猪丁型冠状病毒诱导的细胞线粒体凋亡

猪丁型冠状病毒(Porcine deltacoronavirus,PDCoV)是一种新型的猪肠道致病性冠状病毒,可引起猪群剧烈腹泻及呕吐,但致病机制尚不清楚。本研究检测了PDCoV感染诱导的细胞凋亡。Caspase酶活性检测显示,在PDCoV感染的细胞中,caspase 3、caspase 8和caspase 9的活性随病毒感染量的增多而显著提高,类似的现象未能在紫外灭活病毒感染的细胞中观察到,表明PDCoV感染可同时激活内源性与外源性细胞凋亡通路,并暗示细胞凋亡的诱导依赖于病毒复制。为深入探究PDCoV诱导的内源性细胞凋亡,分别检测胞浆和线粒体中细胞色素C与凋亡诱导因子。结果显示,与正常细胞相比,PDCoV感染细胞从线粒体释放到胞浆的细胞色素C显著增多,且其释放量随着感染时间的延长而增多,而凋亡诱导因子始终定位于线粒体,提示PDCoV感染通过促使线粒体膜间隙的细胞色素C进入胞浆而启动caspase依赖的线粒体凋亡通路。本研究初步揭示了PDCoV诱导细胞凋亡的机制。     

猪miR-331-3p过表达载体的构建及其对细胞增殖的影响

本研究旨在阐明猪miR-331-3p对细胞增殖的影响,探讨其对细胞增殖的作用机制首先构建了miR-331-3p的过表达载体pcDNA 3.1 (+)-miR-331-3p,并将将PK15细胞分为4组,分别为实验组、实验组对照组、抑制剂组和抑制剂对照组。实验组和对照组分别转染pcDNA 3.1(+)-miR-331-3p和pcDNA 3.1(+)。抑制剂组和抑制剂对照组分别转染miR-331-3p Inhibitor和miR-331-3p阴性对照(miR-331-3p NC)。通过在各组添加CCK-8试剂绘制细胞增殖曲线,并使用PI染色检测细胞所处周期比例。同时,利用实时荧光定量PCR(Quantitative real-time PCR,qPCR)检测生长抑制蛋白家族成员5 (Inhibitor of growth family member 5,ING5)、细胞周期蛋白依赖性激酶2 (Cyclin dependent kinase 2,CDK2)、细胞周期蛋白依赖性激酶3 (Cyclin dependent kinase 3,CDK3)、细胞周期蛋白依赖性激酶4 (Cyclin dependent kinase 4,CDK4)、细胞周期蛋白B (Cyclin B)和细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂1A(Cyclindependentkinaseinhibitor1A,CDKN1A)的表达变化。结果表明,实验组miR-331-3p表达量显著升高,细胞增殖曲线表明48 h和72 h时细胞数目均呈现出实验组实验对照组和抑制剂对照组抑制剂组的趋势(P0.05)。与实验对照组相比,实验组处于G0/G1期的细胞比例下调,S期和G2/M细胞的比例上调,抑制剂对照组趋势与之相反;同时,实验组中与促进增殖的基因CDK2、CDK3、CDK4和CyclinB的mRNA表达水平均显著升高,而抑制增殖的基因ING5和CDKN1A均表现出显著下降的趋势。本研究成功构建了miR-331-3p过表达载体,且发现miR-331-3p具有促进猪肾上皮细胞增殖的能力,研究结果为深入研究miR-331-3p在猪生长发育中的作用机制奠定了基础。     

我国实验小型猪的发展现状及展望

实验动物广泛应用于科学研究领域,实验小型猪在医学研究领域中越来越得到重视。中国小型猪种源丰富,不同种群各具特色,遗传性状稳定。近年来中国实验小型猪的研究处于快速发展阶段,生产和使用均在逐年增加。我国发展实验小型猪具有天然封闭群特性和高度近交等得天独厚的条件,品系化、标准化、规模化和产业化是我国实验用小型猪的主要发展趋势。我国实验用小型猪发展当前面临的问题主要表现在:保护力度小、发展阻力大、育成品系少三个方面。育成中国各具特色的实验用小型猪品系需要增加投入,利用先进的科学技术例如基因编辑和动物克隆技术,加速小型猪的定向化培育进程。     

猪胸膜肺炎放线杆菌感染小鼠所致炎症中TLR-4信号通路涉及细胞焦亡

摘要:【目的】探讨革兰氏阴性菌胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus Pleuropneumoniae,APP)感染小鼠致肺病变的分子细胞机制,以改善猪传染性胸膜肺炎的防治。【方法】滴鼻法感染小鼠,观察肺部眼观病变,石蜡切片HE染色观察肺组织病变。RT-PCR和qPCR方法检测小鼠肺部的Caspase-1、Caspase-3、TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-18、TLＲ-4表达量的变化。【结果】小鼠在感染后48h内死亡,解剖后观察小鼠肺部有严重出血和炎症。实验组小鼠肺组织IL-1β、IL-6、IL-18 和TNF-α的表达水平显著增加;TLR-4的表达量显著上调;肺部组织Caspase-1的表达水平明显升高,而Caspase-3的表达水平未见明显变化。【结论】TLR-4信号通路可能参与APP感染引起的肺部炎症的发生,APP感染后激活TLR-4信号通路使有关细胞释放炎症因子,引起的肺部炎症。炎症可能涉及Caspase-1参与的细胞焦亡。     

猪激素敏感脂酶和甘油三酯水解酶基因组织表达特性研究

以八眉猪为研究对象,采用RT-PCR和Western blot方法对猪激素敏感酯酶(HSL)和甘油三酯水解酶(TGH)基因组织表达特点进行了研究。RT-PCR半定量检测显示,HSL基因的mRNA在检测的7种组织中都有表达,其中在脂肪组织表达量较高,中等程度表达于心脏、肝脏、肺、脾和肾脏。TGH基因在7种组织也均有表达,其中肝脏和脂肪组织表达量较高,心脏和肾脏次之,脾脏和肺脏表达量较低。Western blot检测显示,HSL基因在大网膜脂肪和皮下脂肪表达量最高,而在肾脏中没有检测到表达,其他组织中中度表达;TGH基因在大网膜脂肪、皮下脂肪、肝脏、肺脏和脾脏组织中表达,其中在脂肪组织和肝脏组织中表达量最高,而在心脏和肾脏中没有检测到表达。以上结果表明:HSL和TGH基因存在转录后调控,这可能与其在不同组织中的功能差异有关。     

PEDV S蛋白B细胞抗原表位的筛选和鉴定

以猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)S基因的免疫优势区S1(1～2367bp)为靶基因,利用基于gⅢ表达外源多肽的fd丝状噬菌体展示系统,构建S1基因噬菌体展示肽库,以纯化病毒制备的兔抗PEDV多克隆血清为靶蛋白,对S1基因噬菌体展示肽库进行3轮生物淘选,结果获得3个高亲和力的序列,分别命名为S1P1(248～280位氨基酸)、S1P2(442～499位氨基酸)和S1P3(697～742位氨基酸).ELISA和蛋白质印迹结果显示,S1P1、S1P2和S1P3短肽都能被兔抗PEDV多克隆血清识别,其中S1P3反应性最强.为了进一步揭示S1P1、S1P2和S1P3短肽的抗原性,制备了3个短肽GST融合蛋白和它们串连后GST融合蛋白的单因子血清,间接免疫荧光试验(IFA)结果证实,抗S1P2-GST、S1P3-GST和S1P123-GST融合蛋白的单因子血清能够识别Vero细胞培养物中天然的PEDV.