反向遗传操作技术在呼肠孤病毒中的研究与应用

呼肠孤病毒科成员复杂,宿主范围广,对动物危害较大,使用经典遗传学方法解决呼肠孤病毒研究中出现的诸多科学问题受到限制,反向遗传学技术的发展和应用极大促进了呼肠孤病毒的基因组功能、蛋白质的作用、致病机制、新型疫苗开发等方面的研究。本文概述了呼肠孤病毒反向遗传操作技术的发展过程以及应用该技术取得的一些研究成果,并对该技术在呼肠孤病毒研究领域的推动作用进行了展望。     

PEDV S蛋白B细胞抗原表位的筛选和鉴定

以猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)S基因的免疫优势区S1(1～2367bp)为靶基因,利用基于gⅢ表达外源多肽的fd丝状噬菌体展示系统,构建S1基因噬菌体展示肽库,以纯化病毒制备的兔抗PEDV多克隆血清为靶蛋白,对S1基因噬菌体展示肽库进行3轮生物淘选,结果获得3个高亲和力的序列,分别命名为S1P1(248～280位氨基酸)、S1P2(442～499位氨基酸)和S1P3(697～742位氨基酸).ELISA和蛋白质印迹结果显示,S1P1、S1P2和S1P3短肽都能被兔抗PEDV多克隆血清识别,其中S1P3反应性最强.为了进一步揭示S1P1、S1P2和S1P3短肽的抗原性,制备了3个短肽GST融合蛋白和它们串连后GST融合蛋白的单因子血清,间接免疫荧光试验(IFA)结果证实,抗S1P2-GST、S1P3-GST和S1P123-GST融合蛋白的单因子血清能够识别Vero细胞培养物中天然的PEDV.     

携带CD163报告载体的猪诱导多能干细胞株的建立

猪肺泡巨噬细胞(porcine alveolar macrophage,PAM)是包括猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus, PRRSV)在内的多种高致病病毒的受体细胞,是研究病毒与宿主互作机制的重要模型。然而PAM来源有限,难以满足当前需求。利用猪诱导性多能干细胞(induced pluripotent stem cells, iPSCs)向巨噬细胞定向诱导是解决PAM细胞数量不足的有效方法。CD163是PAM细胞的重要标记,也是PRRSV等病毒的主要受体。建立实时报告CD163激活程度的报告系统对于建立并优化猪iPSCs向PAM的诱导分化体系具有指导意义。本研究利用CRISPR/Cas9介导的基因编辑系统,设计靶向CD163终止密码子的sgRNA并构建相应的打靶载体,将其导入到猪PAM中的检测报告系统。进一步将该报告系统导入猪iPSCs中,通过碱性磷酸酶染色、免疫荧光染色和EDU染色等手段来检测其安全性。将猪内源CD163的报告载体系统转染至原代PAM中,检测到了红色荧光的表达,证明了该载体系...