人HPPCn重组蛋白可溶性表达及其增殖活性检测

HPPCn是一种新的肝细胞刺激因子,获得较高纯度的具有生物活性的HPPCn蛋白对研究其生物学功能具有重要意义。HPPCn在重组质粒PET-24a(+)/HPPCn中,诱导表达产物主要以包涵体形式为主。为优化表达条件,运用冷休克表达载体pColdⅡ和无缝克隆技术获得重组质粒pColdⅡ/HPPCn,分别对诱导温度、时间、分子伴侣等诱导条件进行筛选,镍离子柱亲和层析纯化,Western blot分析目的蛋白特异性,不同浓度人HPPCn重组蛋白(0、10、100ng/ml)刺激SMMC7721细胞,免疫细胞化学方法测定Brdu掺入、PCNA表达变化。目的蛋白在培养温度为16℃,终浓度为0.1mmol/L的IPTG过夜诱导时为可溶性表达,最终得到人重组HPPCn蛋白纯度为94.88%,人HPPCn重组蛋白可刺激SMMC7721细胞Brdu掺入增加、PCNA表达水平上调,其刺激作用具有量效关系。通过冷休克表达系统获得可溶性表达的人重组HPPCn蛋白,其具有促进SMMC7721细胞增殖的生物学功能,为深入研究HPPCn的作用机制提供了技术条件。     

基因重组TNFα衍生物TRSP10的高效制备及其对DU145细胞抑制作用研究

利用基因工程技术表达能够促使肿瘤细胞DU145凋亡的肿瘤坏死因子α(TNFα)的衍生物TRSP10,并在体外研究其对DU145细胞的抑制效应。以重叠延伸PCR方法合成TRSP10基因序列,并插入高效表达的质粒载体p KYB-MCS的NdeⅠ和SapⅠ酶切位点之间,优化融合蛋白诱导表达的条件,建立了从载体构建到重组菌表达、制备的工艺技术条件。MTT法检测TRSP10对前列腺癌细胞DU145增殖的抑制作用。实验结果表明:重组菌ER2566诱导表达可溶性融合蛋白的最佳条件是诱导剂IPTG浓度为0.8 mmol/L、诱导表达温度37℃、诱导表达时间8h。利用IMPACT系统及HPLC技术纯化制备TRSP10,得到产物纯度达到96%,质谱鉴定确定其分子质量为3.59k Da,与理论值相符;体外细胞学研究结果表明,TRSP10对前列腺癌细胞DU145有明显的抑制作用,在5,10,20,40μmol/L TRSP10及10μmol/L TNFα阳性对照处理后48h抑制率分别达到11.40%,22.97%,33.26%,48.35%及42.50%。     

植物肉桂酰辅酶A还原酶基因克隆研究进展

木质素单体合成的过程中涉及了许多酶的参与,而肉桂酰辅酶A还原酶(cinnamoyl-CoA reductase,CCR)是该过程中的一个关键酶。综述了CCR基因在植物体内的克隆、基因功能及在植物组织中的表达情况,并介绍了该基因在植物的抗病虫害和抗逆性研究、饲草和能源上的应用潜力,为进一步研究CCR基因生物学功能和利用奠定了基础。     

HBV pre-c-Fc融合蛋白在杆状病毒表达系统中的表达及其生物学活性研究

目的:在杆状病毒表达系统中表达融合蛋白乙型肝炎病毒前C蛋白-小鼠IgG Fc蛋白(HBV precore protein-mouse IgG Fc,HBV pre-c-Fc),并鉴定其免疫原性。方法:目的基因HBV prec-Fc连接到pFastBac1载体,获得的pFastBac1-HBV pre-c-Fc质粒转化DH10Bac感受态,通过Tn7转座子将目的基因转座到Bacmid中,得到Bacmid-HBV pre-c-Fc穿梭载体,脂质体包被后转染Sf9昆虫细胞获得P1代病毒,重复转染Sf9获得高滴度病毒。收集细胞上清超滤后通过Protein G亲和层析柱纯化得到目的蛋白HBV pre-c-Fc。纯化的蛋白大腿内侧肌肉注射免疫BALB/c小鼠并检测血清中乙型肝炎病毒核心蛋白抗体产生量。结果:HBV pre-c-Fc在昆虫细胞中成功表达,纯化后蛋白纯度达90%以上,蛋白产量约为3.03mg/L,纯化蛋白能有效刺激BALB/c小鼠产生特异抗体。结论:成功地在杆状病毒表达系统中表达了具有免疫原性的HBV pre-c-Fc蛋白,为生产乙肝治疗性疫苗奠定了基础。     

sTRAIL蛋白原核表达载体的构建、表达及抗肿瘤活性研究

目的:从HL-60细胞中获得了sTrail基因片段,优化蛋白表达条件,并研究其抗肿瘤活性。方法:培养HL-60细胞,提取总RNA,通过RT-PCR扩增sTRAIL蛋白基因片段,并将目的基因克隆至原核表达载体p ET28a上,并电击转化E.coli BL21(DE3),IPTG诱导表达,优化蛋白表达条件,Ni-IDA柱纯化重组蛋白,SDS-PAGE蛋白电泳,胶内酶解质谱鉴定。纯化后的重组蛋白作用HUVEC,He La,Hep-3B,HCT-116,MDA-MB-231,H460细胞检测蛋白生物学作用。结果:DNA测序结果证实成功构建了重组质粒p ET28a-sTrail,SDS-PAGE蛋白电泳,胶内酶解质谱检测显示成功表达sTRAIL蛋白,MTT法和流式细胞术结果显示,sTRAIL蛋白对肿瘤细胞包括He La,HCT-116,MDA-MB-231,H460,Hep-3B细胞有良好的生物活性,对正常的HUVEC细胞无毒性。结论:成功构建可以高效表达sTRAIL蛋白的原核表达载体,优化蛋白的表达和纯化后所得sTRAIL蛋白具有良好的抗肿瘤生物活性,为研究和发展利用sTRAIL蛋白作为临床治疗抗肿瘤药物提供了重要基础。     

SCoT分子标记在植物研究中的应用进展

SCo T是一种新型的目的基因分子标记,该标记不仅能获得与性状联系紧密的目的基因,而且能对性状进行跟踪,已被广泛应用于多种植物的研究。本文概述了SCo T标记的原理、引物设计方法及特点,并从PCR反应体系建立与优化、种质资源遗传多样性与亲缘关系分析、种质鉴定与指纹图谱构建、基因差异表达与分子遗传连锁图谱构建等方面总结了SCo T标记的应用进展。同时,对其存在的问题进行了讨论,并展望了该标记的发展应用前景。     

改善大肠杆菌衍生型重组双层轮状病毒样颗粒的特性与保护效力

<正>在中高等收入的国家中有效的轮状病毒活疫苗在资源有限的地方的婴儿中却免疫原性和有效性较差。病毒样颗粒(VLP)是轮状病毒疫苗研究有希望的途径,但大规模的VPL生产仍旧是个挑战。此研究用大肠杆菌表达轮状病毒的衣壳VP2和VP6蛋白,通过纯化后的组装工艺高效的组装成同源单层VP6-VLPs或双层VP2/6-VLPs有(d12/6-VLPs),d12/6-VLPs有较好的热稳定性和抗原性。虽然     

幽门螺杆菌重组vacA-CtxB蛋白的原核表达及免疫学研究

目的原核表达幽门螺杆菌pQE-vctB(含H.pylori细胞空泡毒素毒性片段与霍乱毒素B亚单位的融合基因)在E.coil DH5α中诱导表达,以获得重组蛋白,鉴定其抗原性和免疫原性,为制备防治H.pylori感染的口服疫苗奠定基础。方法 (1)pQE-vctB转化E.coli DH5α,IPTG诱导表达重组蛋白VCTB,Western blot分析抗原性,镍离子柱纯化。(2)重组蛋白VCTB口服免疫小鼠,ELISA检测小鼠血清特异性IgG、小肠冲洗液IgA,以鉴定其免疫原性。结果重组蛋白VCTB经SDS-PAGE分析相对分子量(Mr)约为40kD,亲和层析后可获得纯度为92%以上的蛋白。Western blot分析显示能与VacA抗血清反应。ELISA检测显示,免疫小鼠的血清特异性抗体IgG,肠粘液IgA显著高于VacA对照组(P0.01)。结论 vacA和ctxB融合基因原核表达质粒转化E.coli DH5α表达菌获得了重组蛋白VCTB,表达量较高,纯度较高,有良好的抗原性和免疫原性,口服免疫小鼠可明显提高其免疫效果,产生较高水平的IgA,可用于制备防治H.pylori感染的口服疫苗。     

在真核细胞表达制备重组人前蛋白转化酶枯草溶菌素9

分别优化、合成和构建了在毕赤酵母和哺乳动物细胞表达人前蛋白转化酶枯草溶菌素9(proprotein convertase subtilisin/kexin type 9,PCSK9)的PCSK9-p PICZαA和PCSK9-pcDNA4.0重组质粒,将重组质粒转化至GS115细胞和转染至中国仓鼠卵巢(chinese hamster ovary,CHO)细胞,诱导细胞表达包含his标签的PCSK9重组蛋白。通过SDS-PAGE电泳和Western-blot分析两种系统表达重组蛋白的能力,发现GS115表达的重组蛋白相对分子质量大于人天然PCSK9蛋白且容易发生降解,而CHO细胞能够高表达与人天然PCSK9蛋白相对分子质量相同的、稳定的、易于纯化的特异重组蛋白。采用His/Ni2+亲和层析柱纯化重组蛋白,获得纯度达90%以上的PCSK9重组蛋白;用纯化的重组蛋白免疫小鼠制备了高效价特异性PCSK9多克隆抗体。所建立的CHO细胞表达体系PCSK9的平均表达量为5.6 mg/L,为开发PCSK9抑制剂和深入研究PCSK9分子结构和功能奠定了基础。     

高丛蓝莓类黄酮3′-羟化酶基因F3′H的克隆及表达特性分析

以高丛蓝莓(Highbush blueberry)"喜来(Sierra)"和"日出(Sunrise)"为研究材料,通过RACE(rapid amplification of c DNA end,RACE)技术获得蓝莓(Vaccinium ssp.)F3′H基因的全长c DNA序列,并使用生物信息学工具对该基因编码蛋白的氨基酸组成及理化性质、二级和三级结构,以及氨基酸序列的相似性等进行了预测和分析。利用荧光定量PCR(RT-q PCR)手段来检测其在蓝莓果实不同发育时期表达情况。结果表明:Vs F3′H全长c DNA为1 871 bp,编码530个氨基酸,蛋白相对分子质量为58.33 k D,理论p I值为7.32;蛋白疏水性指数为0.004,属于疏水性蛋白,二三级结构预测可知其富含α-螺旋和无规则卷曲。RT-q PCR发现Vs F3′H主要在果实发育前期表达量较高,蓝果期表达量明显下调,且在不同品种中以蓝果期的表达量差异显著。这些研究结果为解析蓝莓果实色泽发育及果树分子育种奠定了理论基础。