内皮细胞靶向的可溶性人源Delta-like 4抑制生理性与病理性眼部血管新生

Notch信号通路在血管新生过程中具有重要作用,是治疗病理性血管新生的关键靶标.Notch信号通路的激活与抑制均可阻抑血管新生,但由于体内长期抑制Notch信号通路会导致血管瘤等严重毒副反应,通过激活Notch信号抑制新生血管形成可能更具临床应用价值.然而,目前缺乏可在体内高效活化Notch信号通路的Notch配体.在众多的Notch配体中,Delta-like4(Dll4)特异性表达于血管内皮组织,对血管新生具有关键调控作用.本研究表达并纯化了新型可溶性人源Notch配体h D4R,其由人源Delta-Serrate-Lag-2片段和内皮细胞靶向的精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(RGD)基序组成.实验证实,h D4R可通过其RGD基序与内皮细胞结合,并可有效激活内皮细胞中的Notch信号.平面管腔形成实验和微球萌出实验显示,h D4R能在体外显著抑制血管新生.更为重要的是,h D4R能在体内有效抑制新生鼠视网膜血管新生和激光诱导的脉络膜新生血管形成.综上所述,本研究发明了一种能显著抑制体内外血管生成的可溶性Notch配体h D4R,为治疗过度血管新生性相关疾病提供了新的手段.     

人源类溶菌酶蛋白6在毕赤酵母中的重组表达及活性分析

利用毕赤酵母(Pichia pastoris)重组表达人源类溶菌酶蛋白6(human lysozyme-like protein6,h Lyzl6),对其酶学性质进行分析。根据毕赤酵母密码子偏爱性设计并人工合成h Lyzl6基因,将其连接至含有乙醇氧化酶启动子(AOX1)的p PIC9K质粒构建重组表达载体p PIC9K-hlyzl6;重组表达载体经线性化后电转化入毕赤酵母GS115感受态细胞,经G418筛选获得高拷贝重组菌株后进行甲醇诱导表达。经甲醇诱导72 h后发酵液上清中酶活性达到最高值,发酵液上清经SDSPAGE检测在14.8 k Da处有重组h Lyzl6蛋白条带,分子量符合预期,通过甲壳素亲和层析可对其进行纯化;采用比浊法测定h Lyzl6酶学活性,结果表明h Lyzl6对溶壁微球菌(Micrococcus lysodeikticus)有较好的杀灭作用,最适反应温度为40℃,最适p H为5.5,其酶活力为54 700U/mg,Cu2+对其活性有明显抑制,EC50为30.2799 mg/L。采用基因工程方法首次在毕赤酵母GS115成功表达了重组h Lyzl6,证实其在体外具有杀菌活性,初步揭示h Lyzl6在男性生殖系统先天性免疫中发挥了一定作用,为进一步研究h Lyzl6的功能和应用开发奠定了基础。     

Photosan脂质立方液晶纳米光敏剂的制备及光动力杀伤效应研究

目的:制备Photosan脂质立方液晶纳米光敏剂,通过体外实验探讨其介导的光动力疗法(photodynamic therapy,PDT)特异性杀伤肿瘤细胞效果。方法:以单油酸甘油酯(glyceryl monooleate,GMO)和泊洛沙姆407(poloxamer 407,P407)为液晶材料,以光敏剂Photosan为模型药物,制备Photosan立方液晶纳米粒,通过Malvern粒径仪和扫描电子显微镜等考察其理化性质;通过MTS法考察Photosan立方液晶纳米粒对正常肝细胞株和肝癌细胞株的暗毒性及光动力杀伤效果。结果:成功制备Photosan脂质立方液晶纳米粒,该纳米粒对人肝L-02细胞和人肝癌Hep G2细胞均没有暗毒性,其介导的PDT对人肝L-02细胞增殖有一定抑制作用[细胞抑制率为(32.9±1.19)%],而对肝癌Hep G2细胞增殖具有更显著的抑制作用[细胞抑制率为(77.9±2.06)%];Photosan立方液晶介导的光动力作用对人正常肝细胞的增殖抑制作用低于Photosan,但对肝癌细胞的增殖抑制作用高于Photosan。结论:Photosan脂质立方液晶纳米粒对人正常肝细胞安全性较好,对肝癌细胞的光动力杀伤效应明显优于Photosan,为光动力治疗癌症提供了创新性方法。     

表达全人源抗人IgE单抗的细胞株构建及筛选

目的:构建及筛选高效表达原创性全人源抗人Ig E单克隆抗体的重组工程细胞株。方法:将采用核糖体展示技术筛选到的原创性全人源抗人Ig E单链抗体(sc Fv)基因改构设计为Ig G1κ型全长抗体,构建重组真核表达质粒并电转染CHO-S细胞,Dot-blot法选取多株高表达克隆进行40ml摇瓶批次培养,再据细胞生长特征及抗体表达量选取高表达克隆进行40ml摇瓶及3L摇瓶流加培养研究,选取候选细胞株并对改构前后抗体的生物学活性进行比较研究。结果:成功构建了p MH3-H、p MH3-L、p CApuro-H、p CApuro-L四种重组真核表达质粒并成功共转染CHO-S细胞。完成了4次电转染8轮细胞克隆筛选,获得两株表达量较高的候选克隆Mab1#和Mab2#,在3L摇瓶流加培养中抗体表达量分别达到470mg/L及499mg/L。生物膜光干涉技术(Bio-Layer Interferometry,BLI)亲和力结果显示Mab1#及Mab2#两株单抗亲和力均达到nmol/L级(10-9),与现有唯一上市的抗人Ig E单抗药物奥马珠单抗(Omalizumab)的亲和力相当。选取Mab1#全长抗体与其改构前的母本单链抗体的表面等离子共振技术(surface plasmon resonance,SPR)中和活性比较结果显示Mab1#抑制h Ig E与FcεRI结合的EC50为3nmol/L,EC90为9nmol/L,较改造前亲和力提高了4.3倍,中和活性(EC50)提高了23.7倍,中和活性(EC90)提高了41.3倍。结论:成功将表达原创性全人源抗人Ig E的单链抗体(约25k Da)改造为亲和力及中和活性均大幅提升的全长抗体(约150k Da),获得2个候选细胞株。     

巨细胞病毒感染的治疗研究进展

人巨细胞病毒(HCMV)为DNA双螺旋病毒,属疱疹病毒科β亚科,是疱疹病毒科中基因组最大的病毒。HCMV通常呈隐性感染,正常人感染HCMV并无临床症状,一旦人体的免疫机能发生变化(如肿瘤、AIDS、妊娠、新生儿和器官移植),HCMV即从潜伏态转化为原发性或继发性的增殖感染,引起严重的临床症状甚至死亡。因此,HCMV的预防和治疗越来越受到关注,就CMV感染的预防及治疗方法进行了综述。     

HPV在育龄妇女生殖道病原体感染分布及其基因分型

目的探讨人乳头瘤病毒(HPV)在育龄妇女生殖道病原体感染分布情况以及基因分型特点。方法收集2013年度来我院妇产科就诊及体检旳育龄妇女,阴道分泌物主要检查滴虫、真菌、淋球菌、细菌、衣原体和支原体,前三者采用涂片法,解脲支原体和人型支原体采用固体培养法,衣原体抗原检查采用乳胶免疫层析法;宫颈刮片标本采用核酸扩增和反向点杂交技术对23种HPV基因型进行检测,然后对检测结果进行分析。结果育龄妇女阴道分泌物标本病原体感染率为39.32%(7896/20080),宫颈刮片HPV感染率为35.09%(634/1807)。HPV感染中单一感染23.19%(419/1807),二重感染6.53%(118/1807),三重感染3.21%(58/1807),四重感染1.16%(21/1807),四重以上感染1.00%(18/1807),单一感染组与其他组比较差异具有统计学意义(P0.05)。高危中以HPV52、58、16较为常见,低危中以HPV43、6型较为常见;以25~35岁年龄段阳性率较高,其他次之。结论育龄妇女生殖道病原体感染比例较高,应引起高度重视。     

柠檬苦素类似物的生物活性和 构效关系研究进展

柠檬苦素类似物;生物活性;构效关系;结构修饰     

人二倍体甲型肝炎灭活疫苗纯化技术的研究

研究人二倍体细胞甲型肝炎灭活疫苗的纯化方法。 经人二倍体细胞培养的病毒液经澄清、浓缩后制成粗制疫苗,采用Sephacryl S 400、DEAE Sepharose FF、Sephadex G 10等柱层析手段进行纯化。试验证明甲型肝炎病毒粗制疫苗经以上3种层析柱纯化后,抗原组分单一,收率达到85%,杂蛋白去除率达85%以上,蛋白总含量、牛血清残留量各项指标符合中国药典要求,适用于大规模生产。     

重症急性呼吸道感染患儿中人鼻病毒分型检测及流行病学分析

目的:调查重症急性呼吸道感染患儿中人鼻病毒(HRV)的感染情况,初步了解不同型别HRV流行病学和临床特点。方法:收集2008年5月至2010年3月北京儿童医院重症急性呼吸道感染住院患儿鼻咽抽吸物样本259份,采用巢式PCR法,先用鼻病毒5′UTR引物筛查样本中该病毒总的感染情况,再用针对VP4-VP2区域的引物对阳性样本进行分型检测;同时对阳性样本进行其他常见呼吸道病毒共感染检测与流行病学及临床特点分析。结果:259例样本中,5′UTR初筛HRV阳性89例(34.4%),与其他常见呼吸道病毒存在共感染54例(60.7%);可通过VP4-VP2分型测序确定39例HRV-A(48.1%)、4例HRV-B(4.9%)、38例HRV-C(46.9%);HRV-A感染率最高的季节分布是秋季;HRV-A和HRV-C型感染者在临床特点上无明显差别。结论:HRV是儿童重症急性呼吸道感染的重要病原之一,新发现的HRV-C基因型感染率与HRV-A相似,但HRV在儿童重症急性呼吸道感染中的病原学意义还须进一步确认。     

2种检测人偏肺病毒感染的荧光定量PCR方法的应用比较

目的:比较基于人偏肺病毒(hMPV)N或L基因的2种检测hMPV感染的荧光定量PCR方法在207例临床呼吸道样本检测中的应用效果。方法:建立基于hMPV N或L基因片段的荧光定量PCR方法,检测2008年5月至2009年3月在北京儿童医院因急性呼吸道感染的住院患儿鼻咽拭子207份,比较2种方法检出率的敏感性和特异性。结果:在207份样本中,2种方法共检出38(18.36%)份阳性样本,基于N或L基因一种方法均检出32(15.46%)份阳性样本,总检出符合率为94.2%(195/207)。另外发现,基于L基因检测为阴性而基于N基因检测为阳性的样本在L基因与引物和探针结合的部分序列有核苷酸的突变。对19例阳性样本的F基因进行进化树分析发现,大多数hMPV属于A2和B2型,只有1例属于B1型。结论:2种荧光定量PCR方法的联合应用,对于临床样本中hMPV的检测更为敏感。