piggyBac转座子介导的转基因叉尾斗鱼的构建

为探讨piggyBac转座子在鱼类动物中应用的可能性,以包含家蚕(Bombyx mori)肌动蛋白3启动子驱动的增强型绿色荧光蛋白(enhance green fluorescent protein,EGFP)基因的piggyBac质粒为载体,以及一个包含piggyBac转座酶的辅助质粒,采用显微注射的方法将其导入叉尾斗鱼(Macropodusopercularis)受精卵中,利用PCR技术证实了piggyBac转座子能够介导EGFP基因进入叉尾斗鱼基因组,并能够稳定遗传到下一代,符合孟德尔遗传规律。EGFP基因遗传到G1代的阳性鱼占交配鱼比率,即外源基因整合率为12.30%。实验证明,piggyBac质粒有可能成为水产动物转基因实验的新型载体。     

CTSB超表达促进体外培养的猪前体脂肪细胞分化

为研究溶酶体组织蛋白酶B(cathepsin B,CTSB)对脂肪细胞分化的影响,本实验构建了Ctsb重组腺病毒超表达载体,包装并侵染体外培养的猪前体脂肪细胞,采用油红O染色,油红O提取比色法检测猪前体脂肪细胞分化的情况,并通过real-time PCR法检测成脂关键基因mRNA水平的变化.结果显示,重组腺病毒Ctsb载体构建成功,转染猪前体脂肪细胞后,使Ctsb的mRNA和蛋白质表达量分别提高了约16倍和12倍. CTSB超表达能促进脂肪细胞的分化和脂质积累,成脂关键基因过氧化物酶体增殖物激活受体γ(peroxisome proliferator-activated receptor gamma, PPARγ)、脂肪酸结合蛋白2(adipocyte protein 2, aP2)的表达量均有显著升高. 研究表明,提高Ctsb的表达能促进猪前体脂肪细胞分化,揭示了Ctsb在猪前体脂肪细胞分化过程中可能发挥关键作用. 研究结果为进一步研究其作用机制奠定了基础.     

南京城市化食物生产消费系统氮素流动变化

城市化的发展对食物生产消费过程中氮素的流动产生了一定的影响。以1995—2012年南京市食物生产消费变化为基础,分析了食物生产消费过程中氮素的流动变化及其引起的环境负荷。结果表明,农村和城镇人均食物氮消费量分别由1995年的5.09 kg人~(-1)a~(-1)和3.04 kg人~(-1)a~(-1)下降至2012年的4.11 kg人~(-1)a~(-1)和2.65 kg人~(-1)a~(-1);与1995年相比,南京市食物消费代价降低了39.29%;农田系统和畜禽养殖系统氮素综合利用率由1995年的18.71%增加至2012年的24.34%,整体低于全国水平,大量的氮素进入环境;1995年食物链引起氮素的环境负荷为100.49 Gg N/a,到2012年下降至69.90 Gg N/a,下降了30.44%。南京城市化的发展增加了食物进口,会使食物生产地的氮环境负荷大幅度增加。     

锁阳中19种无机元素的NIR快速测定模型的建立与适宜测定元素筛选

目的：建立锁阳中19种无机元素含量的近红外光谱(NIR)快速测定模型,筛选适宜采用NIR技术进行测定的元素。方法：采集5个省(区)的82批锁阳样品,采用积分球漫反射方式采集样品的NIR原始光谱,采用电感耦合等离子体-质谱(ICP-MS)法测定Na、K、Ca、Mg、Fe、Zn、Mn、Co、Sr、Ni、Ag、Ba、Ti、Pb、Cr、Cd、As、Hg、Cu等19种无机元素含量的化学参考值,筛选预处理原始光谱的化学计量学方法,筛选最佳波段及因子数,以偏最小二乘法(PLS)建立NIR定量分析模型。结果：K、Ca、Mg、Mn、Co、Sr、Ti、Cr元素的决定系数R2及交叉验证R2均大于0.9,校正均方差(RMSEC)、预测均方差(RMSEP)及留一法交叉验证均方差(RMSECV)在0.52～2.20之间,模型预测值与真实值之间具有较好的相关性,预测性能较好;Ni、Zn元素的决定系数R2及交叉验证R2在0.8～0.9之间,RMSEC、RMSEP及RMSECV在0.49～1.41之间,预测值与真实值之间的相关性一般;Cu元素的决定系数R2及交叉验证R2在0.7～0.8之间,Na、Fe、Ag、Ba、Pb...     

胍丁胺对体外培养脊髓神经元的影响及在谷氨酸诱导损伤条件下的作用

研究胍丁胺(agmatine,AG)对培养脊髓神经元的作用及谷氨酸(glutamate,Glu)损伤后的影响,探讨其对神经元的毒性作用及其可能的机理.采用原代细胞培养法,分离培养胚胎大鼠脊髓神经元,3d后加入不同浓度的AG(0.5～80mg/L)继续培养12、24、36h,接着采用四甲基氮唑蓝法和中性红法分别测定胍丁胺对细胞存活率以及毒性的影响.在加入AG的同时给予2mmol/LGlu对细胞进行损伤,建立体外的损伤模型.然后进行细胞形态学观察、NeuN免疫细胞化学染色、四甲基氮唑蓝法测定细胞存活率、Hoechst33342和PI染色检测细胞凋亡和坏死率,同时对神经元中丙二醛(malondialdehyde,MDA)含量的变化检测,最后对各组进行比较和统计分析.结果发现,AG作用浓度低于40mg/L对正常培养的脊髓神经元的存活没有明显的影响,而80mg/L的AG对神经元生长有毒副作用.在给予Glu损伤后,细胞生长状态较差,细胞出现退化,而且细胞存活率显著下降,细胞坏死和凋亡率显著增高(P<0.05或0.01),而同时给予AG干预(AG-Glu组),细胞生长较正常培养的细胞生长状态略差,但明显优于Glu组,而且细胞凋亡和坏死率降低,细胞存活率增高,MDA含量减少(P<0.05).结果提示AG作为一种新发现的神经递质或调质,在正常生理情况下对神经元的生长没有毒副作用,而在Glu诱导损伤条件下,能够抑制Glu诱导的损伤.其发生机制可能与AG通过拮抗N-甲基-M-天冬氨酸(N-methyl-D-aspartate,NMDA)受体,阻断或抑制Glu的氧化毒性的级链反应有关.     

三个地理群体赤眼鳟遗传多样性的RAPD分析

利用RAPD技术对宿鸭湖、青龙湖和丹江口水库3个野生赤眼鳟群体的遗传多样性进行分析.9个RAPD引物共获得93个扩增位点,其中多态位点56个,多态位点比例为60.22%.3个群体的多态位点比例分别为53.01%、54.12%和57.95%,遗传距离分别为0.1548、0.1613和0.1764,Shannon信息指数分别为0.2249、0.2318和0.2437.群体间遗传距离以宿鸭湖和青龙湖群体最近(0.1257),青龙湖与丹江口水库群体最远(0.1416).结果表明3个赤眼鳟群体的遗传多样性均较丰富,但群体间地理遗传分化差异并不明显.     

超大表面积自驱动微流控芯片的设计与制备

目的:利用新型纳米森林材料,构建一种操作简单、检测快速、灵敏度高的用于现场检测的自驱动微流控芯片。方法:利用MEMS加工技术制备出具有优良光学性能和大表面积的石英纳米森林结构微流道,对该纳米森林结构的高度、宽度/横向尺寸、密度、表面积、光学性能、毛细驱动效果、荧光增敏效果做出评价,利用双抗体夹心的方法进行蓖麻毒素的检测。结果:纳米纤维锥底直径200～300nm,高度约1. 0μm,纳米森林的密度约为10个/μm~2,估测表面积比底面积达5∶1以上。其在波长为680nm处的透光率达89. 5%,驱动流速约5mm/s,与平面结构相比,其饱和荧光显色成倍提高。蓖麻毒素的检测限低于10pg/ml,在10～6 250pg/ml范围内具有较好线性关系。结论:基于纳米森林结构,成功构建了一种具有超大表面积和高灵敏度的毛细自驱动微流控芯片。     

成年转基因小鼠嗅鞘细胞的培养、纯化及生物学特性

已有多项研究表明,嗅鞘细胞具有修复中枢及外周神经损伤的潜能。我们选用了表达增强型绿色荧光蛋白（enhanced green fluorescent protein,eGFP）的成年小鼠,分离其双侧嗅球嗅神经纤维层及嗅小球层细胞,体外原代培养并予以纯化。同时结合共聚焦、相差显微镜,细胞增殖分析及免疫组织化学鉴定等技术,对其生物学活性进行研究。结果表明：（1）原代培养转基因成年小鼠嗅球嗅鞘细胞（Olfactory ensheathing cells,OECs）15d后,主要存在两种不同形态和免疫组织化学特征的细胞。一种是带有长突起的双极或多极OECs,表达P75^NTR（P75 low affinity neurotrophic receptor）、S100和胶质原纤维酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein,GFAP）。另一种则是对Thy 1．1抗体免疫反应阳性,呈扁平或内皮样形态的成纤维细胞。（2）根据不同类型细胞在未覆层的培养器皿上贴壁速度的差异,我们建立了一种简单易行、不需任何抗体或昂贵仪器的细胞纯化方法,获得了大量高纯度的OECs。（3）在连续纯化培养22d后,OECs仍能保持较高的增殖活性。本实验支持和丰富了OECs发育的相关理论,为进一步体内移植修复CNS损伤提供了理想的材料。     

木聚糖酶XYNB分子中折叠股B1和B2间的疏水作用对酶热稳定性的影响

对来源于Streptomycesolivaceoviridis的高比活木聚糖酶XYNB进行同源建模,并结合嗜热木聚糖酶氮末端芳香族氨基酸疏水作用的结构分析,设计了XYNB的T11Y定点突变,观察XYNB分子中折叠股B1和B2的疏水作用对酶的热稳定性的影响。将突变酶XYNB′在毕赤酵母中表达,表达的XYNB′经纯化后与原酶XYNB(同样经毕赤酵母表达后纯化)进行酶学性质比较,结果表明,XYNB′的耐热性比XYNB有明显的提高,但最适温度与原酶一样为60℃。另外,XYNB′的最适pH、Km值及比活性均有一定的改变。实验证实了木聚糖酶XYNB的氮端芳香族氨基酸之间的疏水相互作用与其热稳定性相关,为进一步的结构与功能研究提供了优良的基因材料。     

3种方法检测体外神经细胞存活的技术探讨

为了准确、客观、快速、高效地反映体外培养细胞存活的情况,将PC12细胞以不同密度接种于96孔板中,培养48h后,然后采用结晶紫比色法,中性红比色法,MTT比色法来检测细胞的存活情况,再将所得结果进行比较,比较3种方法的优缺点,寻求最佳检测细胞存活方案．结果发现,不同方法检测细胞存活的范围各不相同．其中结晶紫比色法细胞存活数与比色光吸收值（absorbance value,A值）呈正相关程度较其它两种好,而且检测细胞存活范围最为宽广．