基于猪德尔塔冠状病毒重组核衣壳蛋白的ELISA抗体检测方法的建立与评价

【目的】猪德尔塔冠状病毒(Porcine deltacoronavirus,PDCoV)是近年来新发现的一种猪肠道冠状病毒,2014年首次暴发于美国,随后亚洲多个国家也相继报道,对养猪业构成了巨大威胁。以大肠杆菌表达纯化的PDCoV重组核衣壳(N)蛋白为包被抗原,建立检测PDCoV抗体的间接ELISA方法,为PDCoV的血清抗体检测和流行病学调查提供工具。【方法】以PDCoV CHN-HN-2014株的基因组RNA为模板,通过RT-PCR扩增PDCoV核衣壳蛋白(N)基因的全长cDNA,将其插入原核表达载体pET-30a中,构建原核表达质粒p ET30a-N,转化大肠杆菌Rosetta(DE3),经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(Isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside,IPTG)诱导表达,以纯化的重组N蛋白为包被抗原,建立PDCoV N-ELISA抗体检测方法,评估其特异性、敏感性、稳定性,并用于临床血清的检测。【结果】SDS-PAGE电泳检测证实表达的重组N蛋白主要以可溶性形式存在,Western blotting证实表达的重组蛋白具有反应活性。用纯化的重组蛋白建立的N-ELISA具有良好的特异性、敏感性、稳定性。与中和试验同时检测148份免疫猪血清和102份临床血清,两种方法的阳性符合率为88.99%,阴性符合率为92.90%,总符合率为91.20%。用建立的ELISA方法检测267份临床血清,PDCoV抗体阳性血清的比率为66.67%。【结论】建立的猪德尔塔冠状病毒N-ELISA抗体检测方法与中和试验的符合率高,可用于PDCoV血清抗体检测和流行病学调查。     

新疆维吾尔族2型糖尿病人群肠道中Faecalibacterium prausnitzii的定量研究

目的定量检测新疆维吾尔族2型糖尿病(T_2DM)和糖耐量正常(NGT)人群肠道中的普拉梭菌(Faecalibacterium prausnitzii)水平。方法提取上述人群粪便细菌总DNA后,采用16SrDNA基因实时荧光定量PCR对普拉梭菌水平进行定量检测;运用Pearson分析普拉梭菌水平与研究对象的空腹血糖(FBG)、甘油三酯(TG)、总胆固醇(TC)、体重和体重指数(BMI)的相关性。结果 (1)16S rDNA基因实时定量PCR结果显示:与新疆维吾尔族NGT组相比,普拉梭菌水平在T_2DM中较低(t=2.590,P=0.014),差异有统计学意义。(2)新疆维吾尔族上述人群肠道中普拉梭菌水平与FBG呈负相关(r=-0.434,P=0.012),体重呈负相关(r=-0.359,P=0.044),TG呈负相关(r=-0.410,P=0.034)。结论 Faecalibacterium prausnitzii水平在肠道中降低可能与2型糖尿病的发病有关,其机制需进一步研究探讨。     

白地霉ch-3脂肪酶Ⅰ基因在大肠杆菌中的表达

构建了白地霉脂肪酶Ⅰ的基因工程菌,为进一步进行蛋白质工程改造和脂肪酶应用奠定了基础。从新疆昌吉市油脂化工厂含油冻土中分离得到1株低温脂肪酶产生菌-白地霉ch-3。该菌发酵上清液中的脂肪酶最适作用温度为35℃,在0℃仍可保持66%的相对酶活力。应用PCR技术从白地霉ch-3基因组DNA中克隆得到脂肪酶Ⅰ基因lip1,将该基因与原核表达质粒载体pET-22b（＋）连接,构建重组质粒pETl-ip1,转化E.coliBL21（DE3）,酶切鉴定,筛选得到重组菌。十二烷基磺酸钠-聚丙希酰胺（SDS-PAGE）显示重组脂肪酶Ⅰ的相对分子质量约为5.8×10^4,酶活为2.73 U/mL,表明lip1基因的表达产物具有正常的生物学活性。白地霉ch-3脂肪酶Ⅰ基因lip1能够在大肠杆菌中有效地表达。     

胍丁胺对体外培养脊髓神经元的影响及在谷氨酸诱导损伤条件下的作用

研究胍丁胺(agmatine,AG)对培养脊髓神经元的作用及谷氨酸(glutamate,Glu)损伤后的影响,探讨其对神经元的毒性作用及其可能的机理.采用原代细胞培养法,分离培养胚胎大鼠脊髓神经元,3d后加入不同浓度的AG(0.5～80mg/L)继续培养12、24、36h,接着采用四甲基氮唑蓝法和中性红法分别测定胍丁胺对细胞存活率以及毒性的影响.在加入AG的同时给予2mmol/LGlu对细胞进行损伤,建立体外的损伤模型.然后进行细胞形态学观察、NeuN免疫细胞化学染色、四甲基氮唑蓝法测定细胞存活率、Hoechst33342和PI染色检测细胞凋亡和坏死率,同时对神经元中丙二醛(malondialdehyde,MDA)含量的变化检测,最后对各组进行比较和统计分析.结果发现,AG作用浓度低于40mg/L对正常培养的脊髓神经元的存活没有明显的影响,而80mg/L的AG对神经元生长有毒副作用.在给予Glu损伤后,细胞生长状态较差,细胞出现退化,而且细胞存活率显著下降,细胞坏死和凋亡率显著增高(P<0.05或0.01),而同时给予AG干预(AG-Glu组),细胞生长较正常培养的细胞生长状态略差,但明显优于Glu组,而且细胞凋亡和坏死率降低,细胞存活率增高,MDA含量减少(P<0.05).结果提示AG作为一种新发现的神经递质或调质,在正常生理情况下对神经元的生长没有毒副作用,而在Glu诱导损伤条件下,能够抑制Glu诱导的损伤.其发生机制可能与AG通过拮抗N-甲基-M-天冬氨酸(N-methyl-D-aspartate,NMDA)受体,阻断或抑制Glu的氧化毒性的级链反应有关.     

三个地理群体赤眼鳟遗传多样性的RAPD分析

利用RAPD技术对宿鸭湖、青龙湖和丹江口水库3个野生赤眼鳟群体的遗传多样性进行分析.9个RAPD引物共获得93个扩增位点,其中多态位点56个,多态位点比例为60.22%.3个群体的多态位点比例分别为53.01%、54.12%和57.95%,遗传距离分别为0.1548、0.1613和0.1764,Shannon信息指数分别为0.2249、0.2318和0.2437.群体间遗传距离以宿鸭湖和青龙湖群体最近(0.1257),青龙湖与丹江口水库群体最远(0.1416).结果表明3个赤眼鳟群体的遗传多样性均较丰富,但群体间地理遗传分化差异并不明显.     

CTSB超表达促进体外培养的猪前体脂肪细胞分化

为研究溶酶体组织蛋白酶B(cathepsin B,CTSB)对脂肪细胞分化的影响,本实验构建了Ctsb重组腺病毒超表达载体,包装并侵染体外培养的猪前体脂肪细胞,采用油红O染色,油红O提取比色法检测猪前体脂肪细胞分化的情况,并通过real-time PCR法检测成脂关键基因mRNA水平的变化.结果显示,重组腺病毒Ctsb载体构建成功,转染猪前体脂肪细胞后,使Ctsb的mRNA和蛋白质表达量分别提高了约16倍和12倍. CTSB超表达能促进脂肪细胞的分化和脂质积累,成脂关键基因过氧化物酶体增殖物激活受体γ(peroxisome proliferator-activated receptor gamma, PPARγ)、脂肪酸结合蛋白2(adipocyte protein 2, aP2)的表达量均有显著升高. 研究表明,提高Ctsb的表达能促进猪前体脂肪细胞分化,揭示了Ctsb在猪前体脂肪细胞分化过程中可能发挥关键作用. 研究结果为进一步研究其作用机制奠定了基础.     

锁阳中19种无机元素的NIR快速测定模型的建立与适宜测定元素筛选

目的：建立锁阳中19种无机元素含量的近红外光谱(NIR)快速测定模型,筛选适宜采用NIR技术进行测定的元素。方法：采集5个省(区)的82批锁阳样品,采用积分球漫反射方式采集样品的NIR原始光谱,采用电感耦合等离子体-质谱(ICP-MS)法测定Na、K、Ca、Mg、Fe、Zn、Mn、Co、Sr、Ni、Ag、Ba、Ti、Pb、Cr、Cd、As、Hg、Cu等19种无机元素含量的化学参考值,筛选预处理原始光谱的化学计量学方法,筛选最佳波段及因子数,以偏最小二乘法(PLS)建立NIR定量分析模型。结果：K、Ca、Mg、Mn、Co、Sr、Ti、Cr元素的决定系数R2及交叉验证R2均大于0.9,校正均方差(RMSEC)、预测均方差(RMSEP)及留一法交叉验证均方差(RMSECV)在0.52～2.20之间,模型预测值与真实值之间具有较好的相关性,预测性能较好;Ni、Zn元素的决定系数R2及交叉验证R2在0.8～0.9之间,RMSEC、RMSEP及RMSECV在0.49～1.41之间,预测值与真实值之间的相关性一般;Cu元素的决定系数R2及交叉验证R2在0.7～0.8之间,Na、Fe、Ag、Ba、Pb...     

基于高阶复杂性测度的心率变异信号分析

心率变异性反映了交感神经和迷走神经对心血管系统的综合调节作用,是评价心血管系统功能的重要指标。复杂度是描述时间信号序列信息量的一个重要参数,传统算法中的过分粗略化会丢失大量的有用信息,而高阶复杂度的引入可较大程度地避免这一问题。在利用Lorenz模型数据仿真的基础上,分别对25例正常人样本和25例充血性心力衰竭病人样本的心率变异信号的1～15阶Kolmogorov复杂度进行了计算,通过对比分析后确定,5阶Kolmogorov复杂度在临床医学上可以为分析心率变异信号获得更为理想的效果。     

逆转录病毒介导的人NT—3在嗅神经鞘细胞中的表达及活性检测

本文构建了pRev-TRE-NT-3的逆转录病毒表达载体,通过Ecopack293细胞将其与pRevTet-On分别进行包装,制备了重组缺陷型的hNT-3和Tet-on逆转录病毒,用这两种病毒感染原代培养大鼠神经嗅神经鞘细胞（olfctory ensheathing cells,OECs),并经强力霉素（Dox）诱导,获得Dox浓度依赖性hNT-3表达的OECs,最后经过Western-Blot检测hNT-3的表达以及通过DRG与NT－3转染后OECs联合培养来对表达的hNT-3活性进行鉴定,结果：（1）hNT-3－pcDNA的多克隆位点,用EcoRI和HindⅢ酶切,PCR扩增,再用Sall和Hind Ⅲ切下全长编码的hNT-3cDNA,定向连接到pRev-TRE上,pRev-TRE全长为6．5kb,NT-3全长为0.78kb,pRev-TRE-NT-3重组体经过鉴定,确认插入子的方向和完整性,结果与预期相符。（2）hNT-3修饰的OECs培养上清经Western-blot检测,与hNT-3抗体结合的蛋白条带分子量约为28kd,hNT-3修饰过的OECs上清表达量明显高于未转染组OECs的表达量,且hNT-3表达量与Dox浓度有依赖性。（3）与hNT-3修饰的OECs联合培养背根神经节（dorsal root ganglion,DRG),有许多DRG细胞向外迁移,这些细胞折光性强,突起较长而纤细,并形成复杂的网络。而未修饰的OECs组, 只有少量的细胞迁移生长,细胞迁移和突起生长都很局限,空白对照组的DRG没有向外迁移的细胞和向外延伸的突起;且对照组的突起生长长度明显比NT－3修饰的实验组短（P＜0．01）。这些结果表明,Tet-On调控NT－3表达在OECs转染成功,为进一步体内移植修复损伤提供了理想的材料。     

黄土丘陵区两种主要退耕还林树种生态系统碳储量和固碳潜力

黄土丘陵区是中华文明的起源地,而原有植被却遭受严重破坏。因此,自20世纪70年代末开始的三北防护林工程、退耕还林工程和天然林保护工程等大型生态恢复工程,在本区均有大面积分布。这些工程已经对生态恢复起到重要作用,并将对全球碳素循环起到积极作用。以黄土丘陵区的主要造林树种--油松(Pinus tabulaeformis Carr.)和刺槐(Robinia pseudoacacia L.)为研究对象,共设置样方28个,测定森林乔木、灌木、草本生物量及凋落物碳储量;钻取并分析土样516份,获得土壤有机碳储量。结合文献数据和农田碳储量数据,建立0-86年生油松林和0-56年生刺槐纯林生态系统碳储量-林龄序列;在此基础上分析造林对生态系统碳储量和固碳潜力的影响。结果表明,造林后的油松林和刺槐林生态系统的植被、凋落物及土壤碳储量逐渐增加;在没有人为干扰的情况下,19、27、36、86年生油松林生态系统碳储量分别为70.76、143.43、167.30、271.23-332.26 Mg/hm²;8、17、39年生刺槐林生态系统碳储量分别为80.37、94.08、140.77 Mg/hm²。受间伐干扰、45\,52年生油松林生态系统碳储量分别为136.42\,168.56 Mg/hm²,相对于没有人为干扰的油松林,其植被碳储量明显下降,而土壤碳储量保持稳定甚至升高。受乱砍滥伐干扰的71年生油松林和56年生刺槐林的生态系统碳储量分别为118.87\,76.99 Mg/hm²,相对于没有人为干扰的森林,其植被碳储量和土壤碳储量均呈明显下降趋势。种植油松林之后的86a时间内,其生态系统固碳潜力为211.61-272.64 Mg/hm²;而种植刺槐林、在39a时间内的生态系统固碳潜力为81.15 Mg/hm²。