扩增和纯化携带肌浆网钙ATP酶重组腺病毒的实验方法

目的:通过扩增和纯化rAd.SERCA2a,为转SERCA2a基因研究提供实验基础,并为建立基因库提供稳定可靠的实验方法.方法:用100μL 1.9×10<'12>pfu/ml rAd.SERCA2a感染HEK293细胞,出现细胞病变效应时收获细胞,经物理反复冻融方法及两步氯化铯超速离心方法获得纯化的rAd.SERCA2a,紫外分光光度计比色法测定病毒DNA质粒数.结果:rAd.SERCA2a成功在HEK293细胞表达呈现绿色荧光,纯化的rAd-SERCA2a-GFP DNA质粒数为1.3±0.58×10<'12>pfu/mL,OD<,260>/OD<,280>比值为1.57±0.49(n=50).结论:建立了稳定可靠的借助HEK293细胞培养扩增rAd.SERCA2a的实验方法,纯化后的高效价的SERCA2a基因的重组腺病毒可直接用于心力衰竭的实验研究,对重组腺病毒携带其他基因的扩增与提纯方法也具有一定的参考价值.     

微电极阵列芯片技术研究48h房颤犬左、右心耳电生理特性

目的应用微电极阵列芯片（microelectrode arrays chip,MEA）技术评价48 h房颤（atrial fibrillation,AF）犬左、右心耳（LAA、RAA）的电生理特性。方法随意来源犬12只,以600次/分起搏右心房建立AF模型,分为48 h AF组（n=6）和对照组（n=6）。造模成功后迅速开胸剪取LAA、RAA,置于盛有台式液的MEA中,分别记录AF组及对照组LAA、RAA场电位（field action potential,FAP）形态、振幅、放电频率及激动传导情况。结果 AF组LAA、RAA组织FAP节律绝对不齐,LAA（185.22±25.62）次/分,较对照组（156.44±8.88）次/分增加15.67%（P〈0.01）,RAA（102.39±16）次/分,较对照组（156.44±8.88）次/分减慢34.62%（P〈0.01）。48 h AF组LAA组织电压（458.33±26.73）μV较对照组（740.55±18.93）μV降低38.11%（P〈0.01）,RAA（504.83±39.93）μV较对照组（840.56±18.93）μV明显降低（P〈0.01）,48 h房颤组LAA组织FAP时程（45.28±8.59）ms较对照组（70.77±6.98）ms缩短15 ms（P〈0.01）。RAA（61.78±7.1）ms较对照组（75.83±7.63）ms缩短14 ms（P〈0.01）。48 h AF组LAA、RAA FAP传导异质性增加。结论应用MEA技术可反映心肌组织片场电位电生理特性,48 h AF后LAA放电频率增加,频率绝对不齐,LAA、RAA电压降低,场电位时程延长。     

24小时快速起搏右心房对兔心房单向动作电位的影响

目的应用心内电生理技术研究心房快速起搏(RAP)对兔心房单向动作电位(MAP)的影响。方法成年新西兰兔20只随机分为二组:假手术组、模型组各10只。经颈内静脉将电极置入右心房。以600次/分行RAP,同时分析在0、4、8、12和24h的单向动作电位时程(MAPD)。结果假手术组在实验的时间段内右房游离壁MAP复极90%时程(MAPD90)无明显差别。RAP8h,起搏组右房游离壁MAPD90较P0有明显缩短,从起搏前(112.50±9.57)ms至起搏8h分别缩短到(51.25±4.79)ms,分别缩短了61.25ms。结论房颤(AF)时心房MAPD90缩短。MAP技术可安全地用于研究AF时的电重构(ER),能提供准确的电生理改变的信息。     

同一滴度不同方法转染AAV9-SERCA2a基因对大鼠的有效性和毒副作用评价

目的研究同一滴度不同心脏基因转染方法转染携带肌浆网钙ATP酶2a(sarcoplasmic reticulumCa2+ATPase 2a,SERCA2a)基因的9型腺相关病毒(adeno-associated virus serotype 9,AAV9)即AAV9-SERCA2a对SD大鼠心肌的有效性及对机体毒副作用的影响。方法体外成功构建AAV9-SERCA2a-EGFP病毒载体系统,90只雄性SD大鼠随机分为尾静脉注射(tail vein injection,TVI)组、心肌注射(intramyocardial injection,IMI)组、心包腔注射(intrapericardial injection,IPI)组,采用相应方法在体分别转染滴度1×1011vg/mL AAV9-SERCA2a-EGFP、AAV9-EGFP、NS各200μL。转染后30 d,荧光显微镜下观察心肝肾组织绿色荧光表达情况,Western blot检测SER-CA2a基因在大鼠各组织的相对表达量,体表12导联心电图检测心律失常发生率,HE染色观察病理学变化,心脏彩色多普勒超声评价心功能,血液生化学指标检测肝肾功能。结果三组左心室可见大量绿色荧光表达,IMI组荧光局限在注射点,三组肝肾组织均可见微弱荧光;三组心肌SERCA2a蛋白相对表达量显著高于肝肾(P<0.01),TVI组和IMI组心肌SERCA2a蛋白相对表达量明显高于IPI组(P<0.01);TVI组和IPI组心电图正常,IMI组2只大鼠发生室性早搏;三组转染AAV9-EGFP、AAV9-SERCA2a-EGFP与转染NS相比,心功能、组织病理学、血液生化学指标差异均无显著性(P>0.05)。结论三种方法转染滴度1×1011vg/mL AAV9-SERCA2a基因,TVI法和IMI法在心肌的有效性优于IPI法,TVI法和IPI法对机体的毒副作用小于IMI法,综合三种方法的有效性和毒副作用评价,TVI法优于IMI法和IPI法。     

人胃癌细胞株裸鼠皮下移植瘤模型的建立及其生物学特性

目的初步建立不同浓度下制备人胃癌细胞株BGC-823裸鼠皮下移植瘤模型,观察其生物学特性。方法培养人胃癌细胞系BGC-823细胞,并分别以四个浓度皮下注射于裸鼠腋下每只0.2 mL。根据BGC-823细胞注射浓度将40只裸鼠随机分为四组：组一5×107个活细胞/mL（n=10）;组二1×107个活细胞/mL（n=10）;组三1×106个活细胞/mL（n=10）;组四1×105个活细胞/mL（n=10）。观察各组裸鼠摄食、活动情况、精神状态、死亡率、成瘤时间、成瘤率、肿瘤生长情况,采用免疫组化法检测肿瘤微血管密度。结果各组裸鼠摄食、精神情况正常,无死亡现象。除组四1×105个活细胞/mL浓度组成瘤率为0%外,其余各组成瘤率均为100%,瘤体出现时间在3～7 d,肿瘤血管密度MVD平均为：（123.26±31.57）个/mm2。结论初步建立了人胃癌裸鼠皮下移植瘤模型及建立此细胞系模型的最低浓度。为胃癌的进一步研究奠定了基础。     

清醒状态昆明小鼠随日龄变化的心电图分析

目的研究不同日龄小鼠心电图变化规律,进行初步分析,为小鼠正常及疾病状态下心功能研究提供参考。方法采用标准双极肢体导联(Ⅰ,Ⅱ,Ⅲ)和加压肢体导联(aVR,aVL,aVF),对非麻醉状态的309只不同日龄昆明小鼠行心电图分析。结果记录正常昆明小鼠的心电图参数及形态。心律为窦性心律,平均心率(428.96±93.62)(254～789)次/min。平均RR间期在小鼠1、7、14日龄到成年,从1日龄的(138.89±3.85)ms降到7日龄的(116.75±5.48)ms,14日龄的(109.22±5.06)ms。在14、21、28、35、60日龄小鼠心电图RR间期与1日龄相比均有统计学差异(14、21、28、35日龄、成年小鼠R-R间期差异无统计学意义)。平均PR,QRS,QT,JT间期随着小鼠日龄的增长呈进行性缩短。平均Q-T间期从(46.66±3.56)ms(1日龄)减少到(40.40±3.46)ms(7日龄),(28.22±1.92)ms(14日龄)。14、21、28、35日龄,成年小鼠和1日龄相比差异均有统计学意义(14、21、28、35日龄、成年小鼠Q-T间期差异无统计学意义)。1日龄小鼠的J-S-T段抬高明显,14日龄明显降低,35日龄接近基线甚至消失,类似成年小鼠心电图。结论昆明小鼠随日龄的心电图变化可为评价小鼠心脏的发育及药物干预对心电信号的影响提供一定的参考。     

呼吸科住院患者抗生素药物相关腹泻发生现状及影响因素分析

目的了解呼吸科住院患者抗生素药物相关腹泻发生现状并探讨相关影响因素。方法选取2019年1月-2019年9月我院呼吸科病房收治使用抗生素治疗的患者为研究对象,采用前瞻性队列研究,收集患者基本资料、抗生素使用情况及相关因素,以探讨抗生素药物相关腹泻的影响因素。结果本研究共纳入291例患者,抗生素药物相关腹泻发生率为11.3%。COX回归显示,入院时便潜血(OR=4.730,P0.001)、BMI(OR=0.918,P=0.027)、入院时血红蛋白水平(OR=0.974,P=0.007)、院前抗生素使用(OR=3.246,P=0.011)、单日使用抗生素最大种类数(OR=2.665,P=0.001)为抗生素药物相关腹泻的影响因素,便潜血阳性患者较阴性患者抗生素药物相关腹泻发生率高,入院时BMI、血红蛋白水平低,住院前已开始使用抗生素,单日抗生素使用种类多的患者抗生素药物相关腹泻发生率高。结论抗生素药物相关腹泻为呼吸科住院患者中常见的并发症,临床上对于便潜血阳性患者、BMI和/或血红蛋白水平较低的患者、住院前已开始使用抗生素的患者、感染较重需联合使用抗生素的患者,应在行抗生素治疗方案前做好抗生素药物相关腹泻的预防工作。     

肌浆网钙ATP酶过表达对心房颤动兔心房及L型钙通道alc蛋白表达的影响

目的探讨心肌肌浆网钙ATP酶2a（SERCA2a）基因过表达,对兔急性心房颤动（AF）的心房肌L型电压依赖钙通道蛋白alc亚单位（LVDCCalc）表达的影响。方法48只成年新西兰兔,随机分成为房颤组（AF组,n=12）、9一型腺相关病毒＋增强型绿色荧光蛋白组＋房颤组（rAAV9＋EGFP＋AF组,n=12）、9一型腺相关病毒＋肌浆网钙ATP酶2a＋增强型绿色荧光蛋白组＋房颤组（rAAV9＋SERCA2a＋EGFP＋AF组,n=12）,并设假手术组作为对照（Control组,,l=12）。rAAV9＋EGFP＋AF组和rAAV9＋SERCA2a4-EGFP4-AF组起搏前30d开胸心包腔内注射包含报告基因的rAAV9一EGFP和包含靶基因的rAAV9-SERCA2a—EGFP各500肛L（1×10”v．g／ptL）。转染30d后,AF组、rAAV9＋EGFP＋AF组和rAAV9＋SERCA2a＋EGFP＋AF组,以600BPM刺激频率,持续起搏兔右心房24h制作AF模型。处死各组动物,倒置荧光显微镜下观察右心房肌组织EGFP表达情况,行HE染色对右心房组织形态检查,应用免疫组化技述检测SERCA2a蛋白及LVDCCalc蛋白在心房肌中的表达情况。结果rAAV9＋EGFP＋SERCA2a4-AF组SERCA2a蛋白及LVDCCalc蛋白表达量显著高于AF组和rAAV9＋EGFP＋AF组（P〈0．05）,但与对照组比较差异无显著性。结论心房肌转SERCA2a基因,显著减少了急性房颤心房肌的LVDCCalc蛋白表达的降低,有逆转急性AF电重构的作用。     

星状神经节电刺激建立交感神经介导的急性房颤犬模型

目的建立交感神经张力异常介导的急性房颤动物模型的方法学。方法将16只随意来源犬分为三组：对照组（n=4）,右侧星状神经节（aSG）组（n=6）和左侧星状神经节（LSG）组（n=6）,测定心房和肺静脉不同部位的房颤诱发率、房颤持续时间。结果RSG刺激显著增加右心房（RA）的房颤诱发率和持续时间（P〈0．05）,LSG刺激显著增加左心房（LA）、左上肺静脉（LSPV）、左下肺静脉（LIPV）的房颤诱发率和持续时间（P〈0．05）;与刺激时相比,RSG切除显著降低RA的房颤诱发率和持续时间（P〈0．05）;LSG切除显著降低LA、LSPV、LIPV的房颤诱发率和持续时间（P〈0．05）。结论星状神经节电刺激同时快速心房起搏6h可成功建立交感神经介导的急性房颤犬模型,星状神经节电刺激使心房和肺静脉部位的房颤诱发率显著升高,房颤持续时间显著延长,去星状神经节支配可减少房颤的发生和维持。     

肌浆网钙ATP酶过表达对心房颤动兔心房及L型钙通道a1c蛋白表达的影响

目的探讨心肌肌浆网钙ATP酶2a(SERCA2a)基因过表达,对兔急性心房颤动(AF)的心房肌L型电压依赖钙通道蛋白alc亚单位(LVDCCalc)表达的影响。方法 48只成年新西兰兔,随机分成为房颤组(AF组,n=12)、9-型腺相关病毒+增强型绿色荧光蛋白组+房颤组(rAAV9+EGFP+AF组,n=12)、9-型腺相关病毒+肌浆网钙ATP酶2a+增强型绿色荧光蛋白组+房颤组(rAAV9+SERCA2a+EGFP+AF组,n=12),并设假手术组作为对照(Control组,n=12)。rAAV9+EGFP+AF组和rAAV9+SERCA2a+EGFP+AF组起搏前30 d开胸心包腔内注射包含报告基因的rAAV9-EGFP和包含靶基因的rAAV9-SERCA2a-EGFP各500μL(1×1012v.g/μL)。转染30 d后,AF组、rAAV9+EGFP+AF组和rAAV9+SERCA2a+EGFP+AF组,以600 BPM刺激频率,持续起搏兔右心房24h制作AF模型。处死各组动物,倒置荧光显微镜下观察右心房肌组织EGFP表达情况,行HE染色对右心房组织形态检查,应用免疫组化技述检测SERCA2a蛋白及LVDCCalc蛋白在心房肌中的表达情况。结果 rAAV9+EGFP+SERCA2a+AF组SERCA2a蛋白及LVDCCalc蛋白表达量显著高于AF组和rAAV9+EGFP+AF组(P<0.05),但与对照组比较差异无显著性。结论心房肌转SERCA2a基因,显著减少了急性房颤心房肌的LVDCCa1c蛋白表达的降低,有逆转急性AF电重构的作用。