富油脂微藻育种技术研究进展

微藻因生长迅速、光合作用效率高、分布范围广和油脂积累能力强等优势,已被认为是生产生物柴油的理想原料。诱变育种可改善野生型微藻生长缓慢、油脂含量低和环境适应能力弱等缺陷,提高了以微藻生产生物柴油的可行性。概述了物理、化学和基因工程三类诱变育种方法的研究现状,介绍了低场核磁共振和荧光激活细胞分选两种富油脂微藻筛选技术以及一种测定诱变藻株致死率的方法,讨论了三种诱变方法的应用前景,供相关研究人员参考。     

H1N1流感病毒对小鼠胚胎发育表型的影响

H1N1流感病毒属于常见的致病性病毒。流行病学调查研究表明,新生儿表型缺陷与流感病毒感染有关,但是具体机制还不明确。为了探讨H1N1流感病毒对胚胎发育的影响,本文通过流感病毒感染孕母鼠来构建流感病毒宫内感染的动物模型,分别在胚胎发育至E14.5、E15.5、E16.5、E17.5、E18.5 d以及出生1 d后测量各胚胎的体长,并在体视镜下观察胚胎体表各血管和器官来分析胚胎外表发育的情况,然后采用阿尔新蓝-茜素红染色法观察各发育时期胚胎骨骼发育的情况。结果表明,流感病毒感染的小鼠胚胎的体长明显降低。外部器官发育的差异性可体现在眼、耳等器官,攻毒组成型稍晚,尾部异常卷曲更为严重。各骨骼发育攻毒组较对照组更迟缓,但没有出现长短肢或骨骼缺失等严重异常表型。本研究首次构建了流感病毒宫内感染的动物模型,探究了H1N1流感病毒对小鼠胚胎表型发育的影响。     

牦牛瘤胃中产脂肪酶微生物的分离与鉴定

【背景】脂肪酶是一类特殊的酯键水解酶,广泛应用于工业化生产中,微生物是工业脂肪酶的主要来源。瘤胃中微生物种类繁多、数量庞大,已有关于瘤胃微生物产纤维素酶的报道,尚无产脂肪酶瘤胃微生物的分离筛选报道。【目的】从牦牛瘤胃中分离筛选出能够产脂肪酶的微生物,并进行菌株鉴定及其酶学性质的研究。【方法】以橄榄油为唯一碳源,通过中性红油脂平板进行初步筛选后,用改进铜皂-分光光度法测定酶活力进行复筛;再经形态学观察、生理生化实验和16S rRNA基因序列分析进行菌种鉴定;研究3种脂肪酶的最适作用温度、pH值及金属离子、有机溶剂和表面活性剂对酶活力的影响。【结果】筛选出6株酶活力较高的菌株,其中3株为液化沙雷氏菌,2株为白地霉,1株为卷枝毛霉。脂肪酶的酶学性质研究表明:液化沙雷氏菌、白地霉和卷枝毛霉所产脂肪酶的最适作用温度为45、35和40°C;最适pH为8.0、7.0和7.0;Ca2+和Mg2+对3种脂肪酶均有激活作用;Zn2+对3种脂肪酶有不同程度的抑制作用,EDTA、SDS可使3种脂肪酶失活;3种脂肪酶对丙三醇的耐受力较高,卷枝毛霉脂肪酶对甲醇、乙醇、丙酮的耐受力较高。【结论】从牦牛瘤胃中分离出3种产脂肪酶的微生物,且证实瘤胃微生物在脂肪酶研究方面具有较高的价值。     

西双版纳保护区植物根际细菌的筛选及其促生能力研究

【背景】西双版纳保护区具有丰富的生物多样性,而该区域植物根际细菌特别是放线菌及其促生能力相关报道较少。【目的】从西双版纳保护区根际土壤中筛选出植物根际促生菌,并检测其促生能力。【方法】采用5种不同培养基筛选出植物根际促生菌并通过16S rDNA序列分析进行分类学鉴定,运用Salkowski法测定菌株产IAA的能力,CAS法测定菌株产铁载体能力,钼锑抗显色法测定菌株的解磷能力,CMC-Na法测定菌株产纤维素酶能力和改良的Young法测定产淀粉酶能力,综合评价所得菌株的促生能力。【结果】从土样中分离纯化得到14株典型促生菌,经鉴定分别归属于链霉菌属(Streptomyces)、诺卡菌属(Nocardi)、杆菌属(Bacillus)、中华根瘤菌属(Ensifer)、中慢生根瘤菌属(Mesorhizobium)、固氮螺菌属(Azospirillum)和狭单胞菌属(Stenotrophomonas)。其中菌株B433产吲哚乙酸的能力在培养12 d时达到最大值9.23 mg/L;菌株B351、B453、B546这3株菌株产铁载体的能力较强,其Su80%,最高可达86.67%,强度为+++++;菌株B541的解磷能力最强,磷酸根的浓度达到9.79 mg/L;菌株B442综合产纤维素酶能力最强为31.86 U/mL;菌株B412淀粉酶活力为16.07 U/mL。【结论】西双版纳保护区植物根际土壤促生细菌种类丰富,且具有较强的广谱促生能力,有潜在的开发价值,本研究可为此地的微生物资源开发提供可靠的菌株资源依据。     

一种强力霉素诱导型白念珠菌基因敲除与筛选标记再循环工具包

【目的】在白念珠菌中建立一个快捷方便经济的基因敲除与筛选标记再循环的DNA操作系统。【方法】通过ExoIII介导的不依赖于连接酶的克隆策略,在异源筛选标记基因CmLEU2、CdHIS1和CdARG4基因的两侧分别插入了loxP位点,成为筛选标记基因盒扩增的模板。全基因合成了经过白念珠菌密码子优化的rTetR元件,并组装成Tet-on启动子。将密码子优化的重组酶Cre基因置于该启动子控制下。然后将他们插入筛选标记基因CdHIS1和CdARG4的CDS区域,形成筛选标记基因再循环载体。【结果】构建了3个用于白念珠菌基因敲除的侧翼含有loxP位点的筛选标记基因载体,以及2个含有Tet-on启动子控制的Cre酶的载体用于筛选标记基因的再循环。【结论】成功构建了一个白念珠菌中可诱导的基因敲除和筛选标记再循环的载体系统并成功应用于多个基因缺失株构建。这个系统有助于快速构建白念珠菌的单基因和多基因敲除菌株。     

圣路易斯脑炎病毒NS2B-NS3蛋白酶的原核表达及其抑制剂的筛选

【目的】圣路易斯脑炎病毒(St. Louis encephalitis virus,SLEV)属于黄病毒科,是一种单股正链RNA病毒。黄病毒编码的非结构蛋白NS3在病毒复制以及多聚蛋白加工过程中起着重要作用,NS2B是其发挥作用的重要辅助因子。因此,NS2B-NS3蛋白酶复合物是抗病毒药物的重要靶标。本研究旨在构建SLEV NS2B-NS3蛋白酶的原核表达系统并建立其抑制剂的高通量筛选方法,从而发现其小分子抑制剂。【方法】通过PCR扩增SLEVNS2B-NS3蛋白的编码区,构建原核表达质粒;在大肠杆菌BL21(DE3)中,经异丙基硫代半乳糖苷(Isopropyl β-D-thiogalactoside)诱导得到可溶性的NS2B-NS3蛋白,并用镍亲和层析方法进行纯化;基于荧光共振能量转移(Fluorescence resonance energy transfer)技术检测NS2B-NS3蛋白酶活性,建立其抑制剂的高通量筛选平台。【结果】SLEV NS2B-NS3蛋白酶纯化程度高达95%以上,基于酶活测定的抑制剂筛选平台准确可行。对700多个上市药物进行筛选后,发现原花青素对SLEVNS2B-NS3蛋白酶具有明显的抑制活性。【结论】本研究为SLEVNS2B-NS3蛋白酶抑制剂提供了一种操作方便、高通量的筛选方法,并首次发现了原花青素具有抑制SLEV NS2B-NS3蛋白酶活性的功能,可以作为治疗SLEV感染的潜在靶向药物。     

病毒功能性受体的筛选新策略及其应用

病毒通过与靶细胞表面的特异性受体结合,进而吸附、入侵靶细胞,劫持细胞的复制机器完成自身的复制周期。细胞受体作为病毒入侵宿主的门户,细胞受体的结构与功能及其介导病毒入侵的机制一直是病毒学研究的热点之一。对细胞受体的研究有助于了解病毒的致病机制并为病毒性疾病的防控提供科学依据。近年来,利用功能缺失性基因组学筛选病毒功能性受体的进展极大地拓展了人类对病毒入侵机制的认识和理解。目前,应用较为广泛的病毒功能性受体筛选策略包括RNA干扰技术、利用单倍体细胞系随机插入逆转录病毒致突变技术以及基于CRISPR/Cas9系统的新型编辑技术。本文系统介绍并比较了这三种病毒功能性受体筛选新策略,同时对其应用及优缺点进行了归纳总结,可为相关研究者提供一定的参考。     

具有抗幽门螺杆菌能力的乳酸菌菌株筛选CSCD

目的 在8株乳酸菌中筛选能够抗幽门螺杆菌感染的乳酸菌菌株,为后续研发治疗幽门螺杆菌感染的益生菌制剂提供依据。方法 在8株乳酸菌菌株中,通过对幽门螺杆菌抑菌率的检测及构建人胃腺癌细胞感染模型检测8株乳酸菌对幽门螺杆菌的抑制作用,以及对尿素酶活性的检测判断8株菌的抗幽门螺杆菌的能力。结果 在抑菌试验中,植物乳植杆菌HCS03-001(t=2.938,P=0.008)和副干酪乳酪杆菌HCS17-040(t=3.864,P=0.006)上清液的抑菌作用较强;植物乳植杆菌HCS03-001、罗伊氏粘液乳杆菌RH02100、副干酪乳酪杆菌HCS17-040能够降低幽门螺杆菌对AGS细胞的黏附能力;通过幽门螺杆菌菌悬液与乳酸菌菌悬液共培养,发现植物乳植杆菌HCS03-001(t=6.257,P<0.001)、副干酪乳酪杆菌HCS17-040(t=5.873,P=0.005)抑制尿素酶活性的作用更强。结论 植物乳植杆菌HCS03-001和副干酪乳酪杆菌HCS17-040具有抗幽门螺杆菌感染的能力。     

脂肪酶和酯酶的定向进化及其应用

简单介绍了脂肪酶和酯酶的定向进化的方法和策略。重点介绍了脂肪酶和酯酶的高通量筛选方法及定向进化研究所取得的主要进展。     

单菌落PCR法直接快速鉴定重组克隆*

利用单菌落PCR法直接筛选含有GFP、LTB-ST外源基因的重组克隆,阳性克隆可以扩增出目的条带,和质粒PCR扩增的结果一致。同时,单菌落PCR法也可应用于重组质粒转化后的农杆菌的筛选,单菌落PCR法的扩增结果和农杆菌液扩增的结果一致。结果表明,单菌落PCR法是一个有效简便的鉴定重组阳性克隆的方法。