脂肪酶和酯酶的定向进化及其应用

简单介绍了脂肪酶和酯酶的定向进化的方法和策略。重点介绍了脂肪酶和酯酶的高通量筛选方法及定向进化研究所取得的主要进展。     

嗜热酯酶APE1547催化活性的定向进化研究

对来源于嗜热古菌Aeropyrum pernix的酯酶(APE1547)催化活性进行定向进化研究。利用APE1547特殊的稳定性,建立了准确的高通量高温酯酶筛选方法。对第一代随机突变库筛选获得了催化活性较野生型提高1.5倍的突变体M010,序列分析表明其氨基酸突变为R526S。从第二代突变库中筛选出的总活力提高5.8倍突变体M020,突变位点为R526S/E88G/A200T/I519L,其比活力与M010一致,但表达量比野生型提高约4倍。对M020酶学性质表征发现,其最适pH为8.5,比野生型向碱性偏移0.5;活性中心残基酸性基团的解离常数(pK1)由野生型的7.0提高至7.5。晶体结构分析表明,突变位点R526距离活性中心较近,将其突变为Ser降低了活性中心的极性,抑制了催化残基His的解离,使酸性基团的解离常数升高。     

宏基因组与宏基因组学

宏基因组学诞生于上世纪90年代,是指不经过微生物培养阶段,采用直接提取环境中总DNA的方法,对微生物基因总和进行研究的一门新学科.宏基因组技术的出现,使得人们对占微生物总体99%以上不可培养微生物的研究成为现实,微生物基因的可探测空间显著增大.总的来说,目前宏基因组技术的应用主要分为两个方面:一方面是筛选功能基因,开发具有所需功能的蛋白;另一方面是通过对宏基因组文库进行分析,探讨在各种环境下微生物间相互作用和微生物与周围环境间相互影响的规律,以便我们能更加客观、全面地认识微生物世界.在宏基因组技术的应用范围被不断扩展的同时,围绕着宏基因组文库的构建和筛选、测序和分析等方面的研究已成为宏基因组学发展的主要推动力,宏基因组技术的进步将不断提升其应用价值.     

启动子分析方法的研究进展

启动子是基因表达调控的重要顺式元件,其结构与功能的研究是分子生物学的研究热点之一。对启动子与DNA结合蛋白的研究能从转录水平上阐明基因表达的调控机制,从而为更好地构建基因表达调控网络奠定基础,而且启动子与结合蛋白的研究能够帮助我们寻找新的蛋白质。近年来,启动子的研究方法日益增多,大多是借助于DNA和蛋白质相互作用的特性。本文从原核和真核启动子的基本结构、分类入手,对常用的和改进的几种启动子分析方法进行介绍。如生物信息学分析方法、酵母单杂交(Y1H)技术、瞬时转染法(Transient Transfection)、染色质免疫共沉淀(Ch IP)技术、凝胶阻滞分析(EMSA)试验和DNA足纹(DNase I footprinting)分析法等,从原理、优缺点和最新应用等方面的研究进展进行了综述。对近年来出现的新技术新方法的应用前景作了展望,为启动子的结构与功能研究提供借鉴。