噬菌体治疗细菌性感染的进展

噬菌体是自然界中广泛存在的细菌病毒,作为细菌的天然杀手,在细菌性感染尤其是多重耐药菌感染的治疗方面具有抗生素无法比拟的优势。综述了利用活噬菌体治疗细菌性感染的早期研究及近几年的初步临床试验结果、利用噬菌体裂解酶治疗细菌性感染的最新进展,指出了噬菌体治疗真正得以应用所面临的主要障碍并综述分析了一些具有一定可行性的解决方案,以期为噬菌体治疗的研究和应用提供参考,并推动噬菌体治疗研究的进一步发展。     

用基因组DNA剪接技术克隆SIgA相关基因

目的：克隆分泌型IgA（SIgA）相关基因--J链基因(IgJ)、多聚免疫球蛋白受体基因（pIgR）和IgA重链恒定区基因（IGHA）,为进一步构建SIgA真核表达质粒奠定基础。方法：采用本室建立的"基因组DNA剪接"技术,根据已发表的IgJ、pIgR和IGHA的核苷酸序列,通过计算机软件分别设计各个基因片段外显子的优化引物,从人外周血基因组DNA中直接扩增各基因的外显子序列;然后人工设计融合相邻外显子的融合引物,采用重叠PCR技术,把各基因片段的外显子串联起来形成全长编码序列,完成基因组DNA的体外剪接。扩增的PCR产物纯化后克隆到pGEM-T Easy Vector中,通过DNA测序对阳性克隆进行分析鉴定。结果：PCR扩增的IgJ、pIgR和IGHA基因与预期大小一致;测序结果表明本实验获得的上述基因与GenBank中的目标基因序列完全一致。结论：本文通过基因组DNA剪接技术成功克隆人类SIgA三个相关基因,提示此技术是合成多外显子cDNA的有效手段。     

利用DREAM设计和同源重组进行一步定点突变

目的：建立基于DREAM设计和同源重组的简便、快速定点突变方法。方法：设计两条包含突变的反向PCR（inverse PCR）引物,使其5'端互补从而产生同源重组,同时使用DREAM设计方案在上述引物中引入限制性内切酶位点以便突变子筛选。用能扩增长片段的高保真耐热 DNA聚合酶扩增全长的质粒DNA,直接转化大肠杆菌。转化到细菌中的全长质粒DNA PCR产物可利用其末端同源序列发生同源重组而环化。利用引入的酶切位点方便地进行突变子的筛选。结果：我们用该方法成功地对长度大于7 kb的质粒进行了定点突变。结论：本定点突变无需任何突变试剂盒和特殊的试剂,只需一步反应即可完成;利用DREAM设计使克隆筛选简便可靠,高保真耐热DNA聚合酶可保证多数突变子克隆不发生意外突变,而该酶扩增长片段的能力使该方法适合于大多数质粒不经亚克隆直接突变。     

微生物组测序与分析专家共识

在过去的十几年,微生物组相关研究和应用持续升温。微生物组逐渐成为生命科学、环境科学和医学等领域的研究焦点。与此同时,全球多个国家和组织也都积极发起各自的微生物组计划,进行多方面的布局,力争在这一具有广阔前景的领域获得战略地位。此外,无论是科研还是产业应用已经迎来了研究高潮和投融资热潮,微生物组相关产品和服务也不断出现。然而,行业在快速发展的同时,也存在一些不足。由于微生物组测序和分析相关技术和方法发展迅速,各国研究和应用尚未在技术、方案和数据等标准上达成统一,国内行业参与者对微生物组也存在认识不足,对微生物组相关新方法、新技术、新理论等还未能充分掌握和使用。除此之外,已有的一些标准和指南,内容过于简单,实操性也不足,这不仅给科研数据的整合造成了困难和资源浪费,还给相关企业进行不良竞争、以次充好提供了机会。更重要的是,我国尚缺乏微生物组相关的国家标准,国家微生物组计划仍处于筹备过程。在此背景下,中国生物工程学会、中国科学院微生物研究所于2019年6月至2020年3月,共同设立了“微生物组测序与分析专家共识”专项研究课题。中国生物工程学会组织了微生物组相关领域的27位专家以及来自行业内的30多位专业人员,通过分成4个项目小组、召开4轮研讨会后,最终形成了涵盖从微生物采集与保存、DNA提取与建库、高通量基因测序和数据分析以及质控标准品等全流程的“微生物组测序与分析专家共识”。本专家共识具有较强可参考性和可操作性,不仅能指导国内科研和产业机构规范进行微生物组相关产、学、研,还能为国家相关职能部门提供可参考的技术依据,保障规模型和规范化的企业利益,加强行业自律,避免不规范的企业扰乱市场,最终促进微生物组相关产业的良性发展。     

噬菌体：微小却不简单

噬菌体是专一感染细菌等微生物的病毒,是地球上多样性最高和最丰富的生物体,是生物学研究中重要的模式生物,同时是抗生素耐药菌的天然抗菌剂。噬菌体研究的相关成果极大地推动了生物学各个领域的发展。     

用实时定量PCR解决基因组序列组装中的重复序列问题

目的:探寻一种简单、经济的方法,解决基因组序列拼接中的重复序列问题。方法:选取序列拼接中遇到重复序列问题的质粒NDM-BTR,在其与重复序列相关的contigs两端设计引物,进行实时定量PCR,通过观察临界循环数来判断contig之间的位置关系。结果:成功判断出质粒contig之间的位置关系,得到了质粒基因组完成图。结论:实时定量PCR法可用于解决基因组序列拼接中的重复序列问题,相比较传统建立大片段文库更加简单、快速、经济。     

以HIV-1 5＇LTR为靶点的药物筛选细胞模型的构建

构建以人类免疫缺陷病毒（HIV-1）5＇LTR为靶点的药物筛选细胞模型,用于体外筛选潜在的对HIV-1启动子具有抑制作用的药物,或用于筛选与HIV-1复制相关的宿主因子。通过PCR扩增HIV-1 5＇LTR片段和胸苷激酶基因（thymidine kinase gene,TK基因）,以这2片段为模板进行重叠PCR将两者连接起来,连接产物经酶切后与pcDNA3.1载体连接;将连接正确的质粒转染HEK293细胞同时用G418加压筛选获得稳定细胞系;加入药物更昔洛韦（GCV）检测TK基因的表达。成功构建了HIV-1 5＇LTR调控TK基因表达的稳定细胞系,在其培养过程中加入药物更昔洛韦时,细胞逐渐死亡。构建了以HIV-1 5＇LTR为靶点的药物筛选细胞模型,该模型利用TK基因作为报告基因方便灵敏,可用于筛选针对HIV-1 5＇LTR的潜在抗HIV药物。     

利用高通量测序快速检测疑似感染患者体内未知病原体

采用第二代高通量测序技术从复杂的疑似感染患者组织标本中直接快速检测未知病原体.方法:取临床和实验室均不能确诊的病人血液和淋巴组织,进行病毒DNA和RNA的提取,直接用于第二代高通量测序,将测序结果用于生物信息学分析,与本地化的病毒核酸数据库进行比对,寻找潜在的病毒序列.结果:生物信息学分析显示,3901条序列reads与人内源性病毒K113同源;当使用K113特异性引物对经过Dnasel处理的患者和正常个体进行荧光定量RT - PCR时,发现在患者体内K113病毒基因的表达远远高于正常个体,提示该患者可能存在K113病毒的感染.结论:第二代高通量测序可能用于快速检测未知病原体.     

抗人整合素αvβ3-组织因子融合蛋白基因的构建和表达

目的:利用基因工程技术构建和表达抗人整合素αvβ3单链抗体(scFv)与人可溶性组织因子(sTF)的融合蛋白scFv-sTF。方法:用重叠延伸PCR技术扩增scFv基因,同时用组装PCR方法人工合成sTF基因,然后以酶切连接方式融合2个基因,并克隆至原核表达载体pQE80L中,构建表达质粒pQE80L-scFv-sTF,以重组子转化大肠杆菌M15诱导目的基因表达。结果:SDS-PAGE分析显示工程菌可以表达相对分子质量约55×103的融合蛋白scFv-sTF,Western印迹分析证实表达的目的蛋白具有6×His标签;经低剂量IPTG诱导和较低温度培养,scFv-sTF获得了可溶性表达;纯化回收目的蛋白,ELISA试验证实,该重组抗体分子具有良好的抗原结合活性。结论:构建并表达了抗人整合素αvβ3的单链抗体融合蛋白scFv-sTF,并验证了其抗原结合活性,初步证明它可以与抗原特异性结合,为进一步研究其抗肿瘤作用打下了基础。     

半合成抗体库的构建及抗Tie2 Fab抗体的筛选

构建一个半合成抗体库 ,不经免疫制备人源抗Tie2Fab抗体。通过RT PCR方法 ,从人脐带血淋巴细胞总RNA扩增轻链基因及重链VH段基因 ,将轻链基因插入pCOMb3载体中 ,得人轻链质粒库 ;从HBsAb的Fd段基因制备含有不同长度随机化CDR3的FR3 CDR3 J CH1片段 ,然后将VH段基因与随机化的CDR3融合 ,得到Fd基因片段 ,再将其插入轻链质粒库中 ,得半合成人Fab质粒库。通过多次建库 ,获得总容量为 2× 1 0 7的半合成抗体库。其Fd段和轻链基因的重组率为 5 0 %。经 3轮淘洗 ,从噬菌体抗体库中筛选到与Tie2抗原特异结合的噬菌体克隆。测序确定抗体基因序列