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t-PA突变体山羊乳腺表达载体构建及转染细胞的核移植试验 总被引:2,自引:0,他引:2
构建了t-PA突变体山羊乳腺特异表达载体pGBCt-PAm,包括长4.1kb的山羊β-酪蛋白启动子以及启动子前2.4kb的鸡β-珠蛋白绝缘子序列;并检测了表达载体在家兔乳腺的瞬间表达,验证了载体的有效性。通过电击和脂质体2种转染方式转染了山羊胎儿成纤维细胞(GFFC),经过筛选检测,得到了7株能大量扩增的PCR阳性细胞株。其中的2株(M9,M10)已经进行了首次细胞核移植和胚胎移植试验,2只受体羊2个情期未见返情。 相似文献
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应用克隆的基因组序列作为同源臂 ,构建了小鼠 β 酪蛋白基因定位敲入打靶载体。短臂长 2 7kb ,包括小鼠 β 酪蛋白基因 5′端侧翼区、第 1外显子、第 1内含子、部分第 2外显子。长臂包括小鼠 β 酪蛋白基因部分第 2内含子、第 3~ 7外显子、第 3~ 6内含子、部分第 7内含子 ,长 3 4kb。人t PA突变体cDNA在第 2外显子中与小鼠 β 酪蛋白信号肽序列融合。正筛选标记neo放置在 β 酪蛋白基因第 2内含子中部 ,负筛选标记tk位于短臂外侧。ES细胞株TC 1在滋养层上培养扩增。处理ES细胞使其密度达到 2× 10 7个 /mL后 ,将 4 5 μg线性化的打靶载体DNA与 1mL细胞混匀后电击。转染的细胞在含G4 18和Gancyclovir的选择培养基中培养 ,7d后挑取 192个抗性克隆 ,扩增、提取基因组DNA ,EcoRⅠ酶切后 ,用打靶载体 5′端内侧探针进行Southern杂交 ,野生型出现 9 8kb ,而中靶的 β 酪蛋白基因由于敲入的人t PA突变体携带一个EcoRⅠ位点 ,中靶等位基因出现 6 6kb。从 78株ES细胞株中获得 1株发生正确同源重组的中靶ES细胞。 相似文献
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小鼠β-酪蛋白基因序列调控人t-PA突变体基因在小鼠乳腺的表达 总被引:1,自引:1,他引:0
为验证克隆的小鼠β-酪蛋白基因序列调控外源基因表达的能力,将人人t-PA突变体基因的信号肽-前肽编码序列用小鼠β-酪蛋白的信号肽编码序列替换,人t-PA突变体成熟肽cDNA融合到小鼠β-酪蛋白基因的第2外显子中,从而构建成旨在应用小鼠β-酪蛋白基因序列调控人t-PA突变体基因在小鼠乳腺中表达的载体。融合基因经显微注射到小鼠的受精卵中,285枚注射的受精卵移植到13只受体小鼠,经PCR和Southern杂交鉴定,42只出生小鼠中有12只为转基因阳性鼠。7只转基因阳性鼠乳汁中表达人t-PA突变体,最高表达水平为3.6593μg/ml,证明小鼠β-酪蛋白基因序列能够调控人t-PA突变体基因在转基因小鼠的乳汁中表达出具有生物活性的人t-PA突变体,为进一步制备了人t-PA突变体基因敲入小鼠模型提供了理论和实验依据。 相似文献
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为了提高长效组织纤溶酶原活剂(LAtPA)在转基因小鼠乳腺中的表达水平,将受控于羊β-乳球蛋白(BLG)的LAtPA表达载体BLG-LAtPA与小鼠乳清酸蛋白(WAP)基因片段进行共注射,采用此方法建立的转基因小鼠,经PCR筛选和Southern印迹鉴定,获得3只LAtPA和WAP共整合阳性鼠,并在阳性母鼠乳汁中检测到有溶纤活性的LAtPA表达,表达水平达到10μg/mL。 相似文献
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本文提出了受精卵双原核注射方法,利用共注射具有部分同源区的两个片段鼠乳消酸蛋白基因 (WAP) 调控序列控制下的人粒细胞集落刺激因子 (G-CSF) (Fig.1),通过PCR和Southern Blot检测了8细胞期外源基因的整合(Fig.2)。结果表明,与单一原核注射相比较,双原核注射转基因的整合率由单一原核注射的48.68%提高至62.65%(Table 1)。这为转基因动物建立,提高外源基因整合率提供了新途径。 相似文献
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通过PCR方法从羊肝总DNA中获得了羊-β乳球蛋白(BLG)基因第一和第二内含子,以羊β-乳球蛋白基因(BLG)5’区5kb为调控序列,构建了乳腺表达组织纤溶酶原激活剂突变体载体。对540枚小鼠受精卵进行显微注射,经PCR和Southern blot检测,获得6只整合有人La-tPA的转基因小鼠,整合率为32%。同时研究了转基因在小鼠体内的表达。Northern blot分析表明,在一些转基因鼠乳 相似文献
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小麦染色体显微切割及HMW-GS1Dx5亚基基因克隆 总被引:5,自引:0,他引:5
宏伟的人类基因组计划以及随之而来的动物、植物(如水稻等)基因组计划为克隆有益基因提供了新方法和思路,其中一个令人注目的领域是染色体显微切割。该技术起始于80年代早期,首次应用显微切割和微克隆的是Scalenghe等在果蝇多线染色体上进行的。随后在哺乳... 相似文献
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利用人粒细胞集落刺激因子(G-CSF)基因组基因作为目的片段,将其受控于2.6kb的小鼠乳清酸蛋白(WAP)基因的调控区下,通过显微注射法获得了两只整合有人G-CSF转基因小鼠,通过繁殖建立了稳定的转基因系.一些表型参数测定表明转基因鼠与正常鼠无明显差别.通过RT-PCR及Southernblot检测,在乳腺表达出人G-CSF,为乳腺表达外源蛋白质及今后大动物研究奠定了基础. 相似文献