苏云金芽胞杆菌cry1Ac与烟草几丁质酶tchiB双价基因克隆表达及其杀虫增效作用研究

将苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis,Bt)4.0718菌株质粒上的cry1Ac基因和烟草几丁质酶tchiB基因(去掉信号肽或去信号肽再加肠激酶位点)构建了重组基因。经过双酶切和亚克隆,将带有cry1Ac基因上游启动序列和下游终止序列的重组基因片段克隆至穿梭载体pHT315,分别构建重组质粒pHUAccB6、pHUAccB7,在大肠杆菌中扩增后,将两个重组质粒分别电转化苏云金芽胞杆菌无晶体突变株XBU001中,获得重组菌株HAccB6和HAccB7。经液体双相胞晶分离提取离心后,将晶体和上清液分别进行SDS-PAGE分析,双价基因重组与cry1Ac基因在无晶体突变株中表达量相比较,几丁质酶活性提高5.2倍,双价重组蛋白表达量显著提高,主要产生130kDa蛋白条带。经定量分析:双价重组目的晶体蛋白占总蛋白量的61.38%;Cry1Ac蛋白占总蛋白量的42%。发酵上清液经60%硫酸铵沉淀,显示出一条分子量为18kDa新蛋白条带。经原子力显微镜和电子显微镜观察,表达后的重组蛋白呈菱形或椭原形晶体,其规格约为1.5×3.0μm;经生测分析,重组菌株HAccB6和HAccB7毒力相近,与HAc菌株比较毒力提高4.5倍,对棉铃虫(Helicourpa armigora)具有高效杀虫活性,其3dLC50值分别为9.1μg/mL和11.34μg/mL。研究结果表明,烟草几丁质酶与cry1Ac双价基因重组表达产物具有杀虫增效作用。     

植酸酶及其基因工程研究进展

植酸酶可添加于食品与饲料中,能消除因不能降解的植酸所引起的抗营养作用,提高机体对蛋白质及多种微量元素的利用率,降低粪便中磷的含量,从而减少环境中磷的积累污染,有利于保护生态环境。弄清植酸酶的性质、基因结构和功能,了解其基因工程的研究进展,不仅具有重要的理论意义,而且在开发研究植酸酶制剂用于饲料、食品和医药等方面具有重要的实践价值。本文谨对植酸酶的性质、基因结构和功能及其基因工程的研究进展做一综述,并探讨了植酸酶的应用前景。     

苏云金杆菌4.071 8菌株杀虫晶体性质的研究

研究了苏云金杆菌4．071 8菌株晶体的分离及其在电镜下的形态结构,并通过SDS－PAGE对其杀虫晶体蛋白进行了分析,证明了4．071 8菌株晶体有立方体型和双金字塔型两种,分别由原毒素CryⅠ及CryⅡ组成,该菌对鳞翅目和双翅目昆虫均有毒杀作用。     

高效回收苏云金杆菌质粒DNA的方法研究

介绍三种简易、快速和高效回收苏云金杆菌（Bacillus thuringiensis,简称Bt)质粒DNA的方法。这些方法省时、经济、适用范围广,回收的Bt质粒DNA质量高,可直接用于各种分子克隆操作。     

大肠杆菌-链霉菌穿梭表达载体pMF的构建及其应用

【目的】构建能定点整合到链霉菌(Streptomyces)染色体上的高效表达载体。【方法】以链霉菌自杀型表达载体pLSB2为基础,通过插入链霉菌噬菌体ΦC31整合酶基因int和attP位点(Phage attachment site),构建了能在大肠杆菌和链霉菌之间进行接合转移并定点整合到链霉菌染色体上的表达载体pMF。将pMF转化大肠杆菌ET12567(pUZ8002),并分别接合转移天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolorM145)、变铅青链霉菌(Streptomyces lividansTK24)和红色糖多孢菌(Saccharopolyspora erythraea2338),挑取接合子进行PCR和Southern杂交检测。将来自刺糖多孢菌S08-4的S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因(SAM-s)克隆到载体pMF的启动子下游,接合转移到天蓝色链霉菌中。【结果】表明pMF成功整入链霉菌染色体,并且检测到目的蛋白的表达。【结论】构建的pMF载体可作为外源基因定点整合表达的有效工具,为后续的基因功能研究以及链霉菌的遗传改造奠定了基础。     

苏云金芽胞杆菌cry1Ac与烟草几丁质酶tchiB双价基因克隆表达及其杀虫增效作用研究

将苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis,Bt)4.0718菌株质粒上的cry1Ac基因和烟草几丁质酶tchiB基因 (去掉信号肽或去信号肽再加肠激酶位点)构建了重组基因。经过双酶切和亚克隆,将带有cry1Ac基因上游启动序列和下游终止序列的重组基因片段克隆至穿梭载体pHT315,分别构建重组质粒pHUAccB6、pHUAccB7,在大肠杆菌中扩增后,将两个重组质粒分别电转化苏云金芽胞杆菌无晶体突变株XBU001中,获得重组菌株HAccB6和HAccB7。经液体双相胞晶分离提取离心后,将晶体和上清液分别进行SDS-PAGE分析,双价基因重组与cry1Ac基因在无晶体突变株中表达量相比较,几丁质酶活性提高5.2倍,双价重组蛋白表达量显著提高,主要产生130kDa蛋白条带。经定量分析：双价重组目的晶体蛋白占总蛋白量的61.38%;Cry1Ac蛋白占总蛋白量的42%。发酵上清液经60％硫酸铵沉淀,显示出一条分子量为18kDa新蛋白条带。经原子力显微镜和电子显微镜观察,表达后的重组蛋白呈菱形或椭原形晶体,其规格约为1.5×3.0μm;经生测分析,重组菌株HAccB6和 HAccB7毒力相近,与HAc菌株比较毒力提高4.5倍,对棉铃虫（Helicourpa armigora）具有高效杀虫活性,其3d LC₅₀值分别为9.1μg/mL和11.34μg/mL。研究结果表明,烟草几丁质酶与cry1Ac双价基因重组表达产物具有杀虫增效作用。     

Bt4.0718 cry1Ac基因的克隆与表达分析

在基因库中比对14种cry1Ac基因序列,发现了同源性很高的上游启动子区域和下游终止子区域。根据这一同源序列设计引物,从B t4.0718中扩增出包含双启动子和终止子的4.2 kb片段,用PCR-RFLP检测确定其中含有cry1Ac基因。然后将此片段克隆到穿梭载体pHT304中,转化大肠杆菌DH5α和B t无晶体突变株XZM-101。同时,利用原子力显微镜观察发现重组菌株BXZM34能够产生菱形晶体。     

苏云金芽孢杆菌伴孢晶体20kbDNA中cry1Ac基因的克隆、高效表达和生物活性研究

已经证实苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis,Bt)伴孢晶体结合20kb DNA,但其序列特异性及作用有待进一步研究阐明.研究了选择性溶解Bt 4.0718菌株Cry1类原毒素所形成的菱形伴孢晶体,从中抽提出与其结合的20kb DNA.经Nde Ⅰ酶切消化后亚克隆构建文库,通过PCR-RFLP及测序筛选出含cry1Ac基因的转化子.然后设计引物PCR扩增出cry1Ac基因的ORF并与pET30a连接,转化E.coli BL21(DE3),高效表达了141kD蛋白.表达蛋白占总蛋白量的50%以上,且90%以上以包涵体形式存在.利用穿梭载体pHT304构建表达质粒pHTX42,电转化Bt无晶体突变株XBU001,获得重组菌株HTX42,经SDS-PAGE分析,cry1Ac基因得到强表达,蛋白质定量分析显示目的蛋白量占总蛋白量的79.28%,且其在细胞中累积达细胞干重的64.13%,比文献报道的25%左右高了1倍以上.原子力显微镜(Atomic Force Microscopy,AFM)检测显示,目的基因在大肠杆菌(E.coli)中表达的包涵体呈不规则形状且较小,而在无晶体突变株中表达的晶体呈典型菱形晶体,大小约为1.2 μm×2.0 μm.生测结果显示,包涵体与晶体对小菜蛾(Plutella xylostella)幼虫均有高效杀虫活性.本研究为构建高效杀虫工程菌及进一步阐明Bt伴孢晶体中20kb DNA分子的来源、结构和功能奠定了重要的基础.     

钙粘蛋白与苏云金芽胞杆菌晶体毒素 互作机制研究进展

昆虫钙粘蛋白是苏云金芽胞杆菌晶体毒素的重要受体之一,本文简述了昆虫钙粘蛋白种类、结构特征和在昆虫体内的分布,对昆虫钙粘蛋白与苏云金芽胞杆菌毒素相互结合位点进行了较深入讨论;详细论述了苏云金芽胞杆菌晶体毒素作用孔洞模式和信号转导模式,并简要介绍了钙粘蛋白与昆虫抗性的关系.     

苏云金杆菌4.0718质粒上杀虫晶体蛋白基因的PCR分析

苏云金杆菌（Bacillus Thuringiensis)4.0718由本实验室选育是对鳞翅目（Lepidopteran)昆虫有高毒性的菌株。采用SDS温和提取方法提取此菌株的质粒,电泳纯化后获得了其4种不同分子量的质粒P1,P2,P3,P4。利用序列分析软件对已知的cryⅠ类型基因进行阵列比较,根据其高度保过区域设计了1对通用引物,对cryⅠ类型基因的扩增产物对277bp左右的片段,用此引的对Bacillus thuringiensis 4.0718的4种不同质粒进行了PCR分析,发现质粒P1,P2,P3扩增阳性,都产生了277bp的扩增片段,而质粒P4没有扩增产物,这为进一步的基因定位打下了基础。