人TNF-α双顺反子逆转录病毒载体的构建及其在成纤维细胞中的表达

利用脑炎心肌炎病毒的内核糖体进入位点连接人ＴＮＦ－αｃＤＮＡ和选择基因ＮｅｏＲ基因,使ＴＮＦ－α及ＮｅｏＲ基因均受控于病毒ＬＴＲ启动子,将两基因同时转录至同一ｍＲＮＡ,从而构建成人ＴＮＦ－α双顺反子逆转录病毒载体ｐＧＣＥＮ／ＴＮＦ－α．在ＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ介导下将其导入包装细胞ＰＡ３１７,Ｇ４１８筛选得单克隆,病毒滴度为１０６ＣＦＵ／ｍｌ重组病毒分泌的细胞株．经ＰＣＲ证明外源基因已整合至细胞基因组,Ｎｏｒｔｈｅｒｎ印迹显示出单一ＬＲＴ转录本．持续Ｇ４１８筛选能明显促进目的基因ＴＮＦ－α的表达．用重组病毒上清感染小鼠成纤维细胞ＮＩＨ３Ｔ３,Ｇ４１８筛选获得的混合抗性克隆持续高表达ＴＮＦ－α,４０Ｇｙγ线照射后能维持高效表达至７ｄ．实验结果表明,含ＩＲＥＳ的双顺反子逆转录病毒载体将是一个很好的基因转移载体．     

单纯性生长激素缺乏症的分子基础

单纯性生长激素缺乏症Ia型是常染色体隐性遗传性疾病。运用分子生物学技术已对生长激素基因结构及该病的发病机理有了清楚的了解。同样,运用Southern blot分析技术可使该病在基因水平得到诊断,从而做到产前诊断,以提高优生水平。     

“瘤苗”——细胞因子转导人肿瘤细胞

Ⅰ基因治疗的现状自１９９０年９月美国国立卫生研究院（ＮＩＨ）及食品药物管理局（ＦＤＡ）批准第一个腺苷酸脱氨酶缺乏－严重联合免疫缺陷症（ＡＤＡ－ＳＣＩＤ）临床基因治疗草案至今正好１０年。从美国ＪｏｈｎＷｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ出版社网站１９９９年６月发布的一些信息,可以了解这１０年国际上有关基因治疗研究（指临床）进展的概况。包括我国在内全世界已有２１个国家开展基因治疗临床试验,现有３８０个临床治疗草...     

EGR-1启动子在肿瘤基因治疗中的应用

EGR-1的启动子为早期生长反应因子-1基因上游约-550-0bp的一顺式作用元件。其活性受控于一些诱导剂,如电离辐射,联合EGR-1的启动子与治疗基因（如TNF-α、自杀基因）,用辐射能在肿瘤局部从时,空调控治疗基因的表达,使其产物局限于肿瘤局部,并发挥放疗的杀肿瘤效应,而放疗与转基因产物又有协同作用。放射治疗与基因治疗的配伍为肿瘤的治疗提供了新思路。     

小鼠天然可溶性VEGF受体基因sflt-1的克隆及鉴定

 可溶性血管内皮细胞生长因子受体 (sFlt 1 )与膜表面受体Flt 1竞争结合血管内皮细胞生长因子 (VEGF) ,并且与膜表面受体Flt 1及KDR形成异源二聚体 .完全阻断VEGF的生物学活性 ,除与sFlt 1的结合部位结构域有关外 ,还与整个蛋白质分子的高效分泌表达有关 .而蛋白质分子的高效分泌表达与蛋白质在细胞内高尔基体及内质网的加工密切相关 ,基因工程重组可溶性受体由于一些尚未明了的原因 ,往往不能高效表达 ,从而大大影响了其应用价值 .利用RT PCR技术从胚胎小鼠中扩增出天然可溶性VEGF受体基因sflt 1 ,克隆于pcDNA3载体中 ,在COS 7细胞中短暂表达 ;并克隆至pET42b载体中 ,经IPTG诱导后 ,可大量稳定表达与His Tag形成的融合蛋白 ,经HisNi柱纯化 ,可特异性结合VEGF .可溶性受体sFlt 1在肿瘤组织的高效表达可有效阻断新生血管的形成 ,从而为肿瘤的治疗探索一种方法 .     

人脑胶质瘤c DNA文库的构建

<正> 本室曾制备得到两株单克隆抗体,分别特异地针对两种胶质瘤相关抗原-47kD和180kD的膜糖蛋白。为了阐明这两种胶质瘤相关抗原的生物化学本质及其在正常胶质细胞向恶性转化过程中可能起的作用,我们构建了一个λgtll表达型的人脑胶质瘤cDNA文库,以便用上述单克隆抗体作为探针,从该文库中筛选出与之对应的胶质瘤相关抗原的cDNA克隆。现将建库工作简述于下。     

中国人群主要组织相容性复合物基因多态性及其与疾病相关性的研究

人类的主要组织相容性复合物(major histocompatibility complex,MHC)又称为人类白细胞抗原系统(human leukocytc antigens,HLA)。 MHC基因位于第6号染色体短臂,分布于2—3×10~6bp长度的DNA链上。根据结构和功能,HLA抗原可分为三类。HLA-Ⅰ类抗原,主要是HLA-A,-B,-C基因产物,存在于所有有核细胞的表面,这类也是经典的组织抗原,是淋巴细胞排斥带有异己抗原或病毒感     

人U6基因POI Ⅲ启动子表达反义VEGF cDNA抑制SMMC-7721肝癌细胞VEGF表达的观察

 由 RNA聚合酶启动子在细胞内转录高浓度反义 RNA是抑制靶蛋白的一种有效手段 ,有报道 POI 启动子转录小分子 RNA存在效率不高 ,带有较多的非特异性序列等缺点 ,为了克服这些问题 ,表达反义 VEGF RNA的人 U6基因表达盒对人肝癌细胞株 SMMC- 772 1 VEGF表达的抑制作用进行了研究 .首先 PCR扩增 2 0 0 bp VEGF c DNA以正、反向插入人 U6 sn RNA.通过测序证实反向插入的正确性 .采用细胞原位杂交 ,RNA酶保护分析 ,Northern印迹来证实反义 RNA表达的情况 ,利用 RT- PCR方法研究了其对人肝癌细胞株 SMMC- 772 1 VEGF表达的抑制效果 .细胞原位杂交结果显示 U6启动子转录产物主要分布于细胞核内 ,细胞浆内亦有表达 ,RNA酶保护分析显示 U6基因 POI 启动子能高表达所需大小反义 RNA,Northern印迹结果显示脂质体 lipo-fectamine介导含 U6基因 POI 启动子的质粒转染人肝癌细胞株 SMMC- 772 1后 1 2 h即有表达且可持续表达 6 d. RT- PCR证实 U6基因 POI 启动子转录的反义 VEGF RNA能有效抑制SMMC- 772 1细胞 VEGF的 m RNA表达 .已有的研究结果揭示 POI 启动子是反义基因治疗中一种好的选择     

细菌内同源重组法制备mIL-12腺病毒载体及其体外高效表达

利用细菌内同源重组法构建含 m IL- 1 2双顺反子重组腺病毒载体 ,其中由 polio IRES连接的 m IL- 1 2 p40和 p35双亚基目的基因片段用 Not +Xho 酶自真核表达载体 pc DNA3/m IL- 1 2中切出 ,亚克隆至经同样酶切的腺病毒穿梭质粒中 ,形成转移质粒 p Adtrack- CMV/m IL- 1 2 ,对之线性化后与腺病毒基因组质粒 p Adeasy- 1共转化 BJ51 83菌 ,抽提经鉴定含目的基因的重组体质粒DNA,转染 2 93细胞 ,包装成重组体腺病毒 Ad- m IL - 1 2 . Southern杂交证实 ,p40和 p35基因已被克隆至 Ad- m IL - 1 2基因组中 ;RT- PCR结果显示 ,Ad- m IL- 1 2感染的 MM45T· Li肿瘤细胞中有p40和 p35基因的表达 ,ELISA检测感染 48h细胞的上清中 m IL- 1 2的含量达 88ng每 1 0 6细胞 ,其体外能刺激小鼠脾脏淋巴细胞的增殖 ,提高 NK细胞活性及诱导 干扰素的产生 .结果表明 ,利用细菌内同源重组法制备的 Ad- m IL- 1 2重组腺病毒载体是一种方便、高效、成功率高的方法 ,所制备的重组体腺毒在体外能有效表达具有生物活性的 m IL- 1 2 ,为今后的体内应用奠定了基础 .