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介绍一种快速印迹杂交法 总被引:1,自引:0,他引:1
本文介绍一种快速的细胞mRNA及DNA印迹法。本方法以细胞数为单位,将细胞破碎后在高浓度NaI存在的条件下直接点样于硝酸纤维滤膜上用于核酸的杂交。用本方法可以检测细胞中特异mRNA和DNA的含量,主要用于细胞中特异mRNA的半定量分析和不同细胞之间特异mRNA表达的比较,也适用于分析比较细胞接受各种刺激前后特异mRNA含量的变化。 相似文献
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从人外周血单核细胞中抽提总RNA为模板,分别用5’含EcoRⅠ、3’含BamHⅠ限制性酶切位点的细胞因子基因特异引物合成合信号肽全长IL-2、γ-IFN及α-TNFcDNA.然后将这些细胞因子cDNA分别重组入含筛选标记基因Neo的逆转录病毒载体LXSN中.采用磷酸钙共沉淀法转染逆转录病毒包装细胞系PA317.分别收集到含IFN-γ、TNF-α和IL-2基因的缺陷型逆转录病毒上清及只具空白载体质粒pLXSN的病毒上清这四种病毒颗粒用于导入人肝癌、胃癌细胞,可获得单克隆化的细胞因子基因修饰株PCR,Southern,RT-PCR及Northern杂交证明,有相应细胞因子及筛选标记基因的转入和表达生物活性分析也证实各基因修饰株细胞培养上清液中有一定活性的相应细胞因子.结果表明逆转录病毒介导的细胞因子基因转移是成功的 相似文献
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重组逆转录病毒介导基因治疗(RMGT)的安全性问题许旻,陈诗书(上海第二医科大学人类基因治疗研究中心,上海200025)关键词逆转录病毒,基因治疗,安全性重组逆转录病毒载体系统是基因治疗中最常用的工具。它具有以下优点:①复制缺陷型病毒颗粒比较安全;②... 相似文献
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腺病毒载体具有在离体细胞和动物体内高效转移和表达外源基因的优点,但由于第一代腺病毒载体能在靶细胞内表达病毒结构蛋白,并诱导机体的细胞和体液免疫反应,影响了目的基因在体内的稳定表达。为了克服这一缺点,构建了一种辅助病毒依赖型腺病毒载体HAdI-hFVII。该载体去除了病毒基因组的l3、L1、L2、VAI-VAI、pTP等基因序列。在第一代重组病毒AdI-hFVII辅助下,能在293细胞包装和扩增。经氯化铯梯度超速离心后,能与辅助病毒有效分离。小鼠体内研究表明,该载体能在体内高效转移和表达hFVII基因。与笫一代腺病毒载体比较,外源基因表达稳定性明显提高,提示该载体在体内具有较低的免疫原性。 相似文献
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氨是蛋白质代谢的一种中间产物,对机体具有毒性。在正常生理情况下,氨虽在体内不断生成,但其大部分在肝中合成尿素而消失,另一小部分则可与谷氨酸结成谷氨酰胺。这是机体解除氨毒的二种主要方式。前一方式只在肝中进行,后一方式也可以在肝中进行;所以肝脏是氨代谢与解毒的主要器官。 相似文献
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利用已建立的蛋白质酪氨酸磷酸酶α(PTPα)诱导表达模型寻找与PTPα高表达导致NIH3T3细胞恶变早期相关的新基因 ,探索肿瘤早期形成的机理 .诱导PTPα表达 2 4h ,用差异显示逆转录PCR获得 65条差异片段 ,利用生物信息学方法分析这些差异片段 .发现其中含有 2 9种已知基因 ,12种已知ESTs ,6种未知ESTs .对EST片段 ,利用芯片拼接 (insilicocloning)的方法获得 2条新的带有完整开放阅读框 (ORF)的全长cDNA .利用生物信息学方法分析其同源性、二级结构、功能模体(motif)、保守区、结构域和家族分布情况 ,并且对这 2条新全长cDNA进行部分克隆测序鉴定 ,用半定量RT PCR实验证实其差异表达的真实性 .结果表明 ,这 2条全长cDNA为新基因 (GenBankAY0 35 2 12 ,AY0 35 2 13) ,它们在PTPα诱导表达前后确实存在差异表达 ,并与细胞能量代谢及酶功能相关 ,为进一步探讨肿瘤早期形成机理打下基础 相似文献
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复制缺陷型腺病毒载体介导的人凝血因子Ⅷ基因在体内外的高效转移和表达 总被引:1,自引:0,他引:1
为了构建含人凝血因子Ⅷ基因的重组腺病毒载体系统,首先构建了含FⅧ(B结构域缺失型)的载体质粒pAd-hFⅧ和插入内含子结构的pAdI-hFⅧ,经脂质体介导,证明两质粒的目的基因均能在COS-7细胞中表达有凝血活性的FⅧ因子,其中经纯化的载体质粒pAd-hFⅧ与pBHG10经脂质体介导,共转染至293包装细胞,经同源重组和E1蛋白反式互补,形成E1/E3缺失型重组腺病毒载体颗粒Ad-hFⅧ.PCR检则到病理293培养液上清的病毒DNA中具有目的基因扩增片段,证明病毒DNA含有FⅧ基因.经扩增、纯化、滴度测定,用于感染离体细胞COS-7、A549、L929、293.证实该病毒能在上述细胞中高效转移和表达目的基因,其表达量具有一定范围内的剂量依赖性.COS-7细胞中,MOI>1000时,有细胞毒效应,表达量反而下降.经耳缘静脉注射Ad-hFⅧ至家兔后,1~4周能测到一定水平的FⅧ蛋白,1周内升至最高峰.免疫组化研究表明感染的离体细胞和家兔肝等组织均有FⅧ表达,其中肝脏表达最高.为甲型血友病的基因治疗开辟了新途径 相似文献
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鼻咽癌中感染的EBV以潜伏态存在,只有少数基因得到表达。我们从分子生物学水平研究其潜伏机制。已知BZLFl基因和BamHIEZ片段内部分基因对EBV的复制激活起关键作用。我们用体外基因扩增(PCR)法扩增BZLFl基因外显子-1序列,并用序列分析法研究了该基因结构特点。此外,检测了BamHIEZ片段内缺失,结果发现21例鼻咽癌(NPC)组织中,ll例有BamHIEZ片段内缺失,长2.99kb,与潜伏态存在的RajiEBV类似。提示鼻咽癌小的EBV以潜伏态存在,与NPC发病有关。 相似文献